Name: analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av ett stipendium från National Institutes of Health (GM070736) till H. Fölsch. SF Ang stöddes av en A * STAR Graduate Stipendieutdelning, och RS Kang stöddes av den cellulära och molekylära grunden för sjukdom Training Program (GM8061)

1. Isolering av Plasmid DNA <ol><li> Använd ett Sigma-Aldrich endotoxin-fri maxiprep kit för att förbereda endotoxin gratis DNA enligt tillverkarens protokollet. Detta kit fungerar för oss, eftersom det säkert tar bort alla endotoxiner från DNA förberedelser. Endotoxiner som injiceras med DNA i cellkärnan kommer att leda till celldöd. </li><li> Tillsätt 100 l fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) till isolerade DNA, virvel och snurra i 1 min vid 13 tusen varv i ett Eppendorf mikrocentrifug. Överför ...

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Den mest kritiska stegen för en lyckad mikroinjektion experiment är kvalitet och renhet av DNA och polariteten av dina celler. Utan polariserade celler, kommer din injektion kontroll redan har mistargeted VSVG och experimentet kan inte användas. Om DNA är av dålig kvalitet, kan DNA täppa injektionsnålen som leder till dålig eller ingen uttryck av det önskade proteinet alls. Dessutom är det tillrådligt att använda uttrycket plasmider som är kända för att leda till höga uttryck nivåer som pRKV. <p cla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Axiovert 200 mikroskop med uppvärmd stadium </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Anpassad för </td></tr><tr><td> Injectman NI2 Femtojet mikromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> Anpassad för </td></tr><tr><td> Femtotips II (mikroinjektion nålar) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader tips </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Rensa 12-mm transwell filtret stöder </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxin-fri plasmid maxiprep kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Epitelceller polarisera sina plasmamembranet i biokemiskt och funktionellt olika apikala och basolateral domäner där apikala domän står det &quot;fria&quot; ytor och basolateral membranet är i kontakt med underlaget och angränsande celler. Båda membran domäner är åtskilda av tight junctions, som utgör en diffusionsspärr. Apikala-basolateral polarisering kan rekapituleras framgångsrikt i kultur när epitelceller som Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler är seedade i hög densitet på polykarbonat filter och odlade i flera dagar 1 2. Upprättande och underhåll av cellens polaritet regleras av en rad små GTPases av Ras superfamiljen som Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 och Rab13 3 4 5 6 7. Liksom alla GTPases dessa proteiner växla mellan en inaktiv BNP-bundet tillstånd och ett aktivt GTP-bundet tillstånd. Specifika mutationer i nukleotid bindande regionerna störa denna cykel 8. Till exempel är Rab13T22N permanent låst i BNP-form och därför kallas &quot;dominerande negativ&quot;, medan Rab13Q67L inte längre kan hydrolysera GTP och är därmed låst i ett &quot;dominerande aktiva&quot; status 7. Att analysera deras funktion i celler både dominerande negativa och dominerande aktiva alleler av GTPases normalt uttrycks på höga nivåer för att störa funktionen av kroppsegna proteiner 9. Ett elegant sätt att uppnå en hög nivå av överuttryck i en kort tid är att införa de plasmider som kodar för relevanta proteiner direkt i kärnan av polariserade celler som odlas på filtret stöder med mikroinjektion teknik. Detta kombineras ofta med samtidig injektion av reporter plasmider som kodar för receptorer plasmamembranet som är specifikt sorteras till apikala eller basolateral domän. En last som används ofta för att analysera last sortering till basolateral domänen är en temperaturkänslig varianten av vesikulär stomatit virus glykoprotein (VSVGts045) 10. Detta protein kan inte lägga sig ordentligt vid 39 ° C och blir därmed kvar i endoplasmatiska retiklet (ER), medan det föreskrivande proteinet av intresse är monterade i cytosolen. En övergång till 31 ° C att sedan låta VSVGts045 att lägga på rätt sätt, lämna ER och resa till plasmamembranet 11. Denna jakt är vanligtvis utförs i närvaro av cykloheximid för att förhindra ytterligare proteinsyntesen vilket leder till renare resultat. Här beskriver vi i detalj förfarandet för microinjecting plasmider till polariserade celler och efterföljande inkubationer inklusive temperatur förändringar som gör en omfattande analys av reglerande proteiner involverade i basolateral sortering.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Den här artikeln detaljer förfarandet i samband överuttryck och analys av små GTPases i polariserade epitelceller med mikroinjektion teknik.

Analysera funktion Små GTPases genom mikroinjektion av plasmider till Polarized epitelceller

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Mikroinjektion av Zebrafish embryon till Analysera genfunktion

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Mus bröst epitelceller formen Mammospheres Under Lactogenic Differentiering

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear mikroinjektion av DNA i dissocierade vuxna däggdjur Neuroner

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analys av mRNA Nuclear Export Kinetics i däggdjursceller genom mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantation av celler direkt in i njuren för vuxna Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosoliska Kalcium Mätningar i Renal epitelceller med flödescytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...