Name: analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Sağlık (GM070736) National Institutes of H. Fölsch bir hibe ile finanse edildi. SF Ang A * STAR Lisansüstü bursu tarafından desteklenen ve RS Kang Hücresel ve Moleküler Temelleri (GM8061) Hastalığı Eğitim Programı tarafından desteklenen

1. Plazmid DNA İzolasyonu <ol><li> Üreticinin protokole göre endotoksin DNA hazırlamak için Sigma-Aldrich endotoksin maxiprep kiti kullanın. Bu kit, güvenilir bir şekilde herhangi bir DNA hazırlıkları endotoksin kaldırır, çünkü bizim için çalışır. DNA hücre çekirdeklerinin içine enjekte edilir endotoksin, hücre ölümüne yol açacaktır. </li><li> Izole edilmiş DNA, girdap ve bir Eppendorf mikrosantrifüj 13.000 devirde 1 dakika için spin ul 100 fenol / chlorofom / izoamilalkol (25:24:1) ek...

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

, Başarılı bir mikroenjeksiyon deney için en kritik adımlar hücrelerinin DNA ve polarite kalite ve saflık. Polarize hücreler olmadan, enjeksiyon kontrolü zaten VSVG mistargeted olacak ve deney kullanılamaz. DNA kalitesiz ise, DNA yoksullara açan bir iğne ya da istenilen protein hiçbir ifade tıkayabilir. Ayrıca, böyle pRKV gibi yüksek ekspresyon düzeyleri yol açtığı bilinen ifade plazmid kullanmak için tavsiye edilir. Diğer kargo proteinler sıralamak için test etmek ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Isıtmalı aşaması ile 200 Mikroskop Axiovert </td><td> Carl Zeiss A.Ş. </td><td> Özel sipariş </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet mikromanipülatör </td><td> Eppendorf </td><td> Özel sipariş </td></tr><tr><td> Femtotips II (Mikroenjeksiyon iğneler) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader ipuçları </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Clear 12 mm transwell filtre destekler </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoksin ücretsiz plazmid maxiprep kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Apikal etki &#39;ücretsiz&#39; yüzeyleri yüzleri ve bazolateral membran substrat ve komşu hücrelerle temas biyokimyasal ve fonksiyonel olarak farklı apikal ve bazolateral etki alanı içine plazma zarı kutuplaştırırlar epitel hücreleri. Her iki membran etki, bir difüzyon bariyeri oluşturan sıkı bağlantıları ayrılır. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri, epitel hücreleri polikarbonat filtreler yüksek yoğunluklu numaralı seribaşı ve birkaç gün 1 2 kültüre Apikal-bazolateral kutuplaşma kültürü başarıyla değinmeyecek. Ras süperailesinin RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ve Rab13 3 4 5 6 7 gibi küçük GTPases bir dizi hücre polarite kurulması ve bakımı tarafından düzenlenir. GDP-bağlı etkin olmayan bir devlet ve aktif bir GTP bağlı devlet arasındaki tüm GTPases gibi bu proteinlerin döngüsü. Bu bisiklet 8 ile nükleotid bağlayıcı bölgelerinde spesifik mutasyonların etkileyebilir. Örneğin, Rab13T22N kalıcı GSYİH-form kilitlenir ve böylece &#39;olumsuz baskın&#39; olarak adlandırılan, Rab13Q67L artık GTP hidroliz ise ve bu nedenle bir &#39;baskın aktif&#39; devlet 7 kilitlenmiş durumda . Hücreleri, kendi işlevlerini analiz etmek GTPases iki baskın baskın negatif ve aktif allel genellikle endojen proteinlerin 9 fonksiyonu ile müdahale yüksek seviyelerde ifade edilir. Kısa bir miktarı aşırı ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak için zarif bir şekilde, filtre, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak destekler yetişen polarize hücrelerinin çekirdekleri doğrudan ilgili proteinleri kodlayan plazmid tanıtmaktır. Bu çoğu zaman özellikle apikal veya bazolateral etki alanı sıralanır plazma membran reseptörleri kodlayan plazmid muhabiri ko-enjeksiyon ile birleştirilmiştir. Bazolateral etki sıralama kargo analiz etmek için sık sık kullanılan bir kargo veziküler stomatit virüsü glikoprotein (VSVGts045) 10 ısıya duyarlı bir allel . Bu protein, 39 ° C&#39;de düzgün bir şekilde katlayın ve ilgi düzenleyici protein sitoplazmada monte edilir ve böylece endoplazmik retikulum (ER) muhafaza edilecektir. Bir kayma ile 31 ° C VSVGts045 plazma zarı 11 ER ve seyahat düzgün kat terk etmeye izin verecek. Bu kovalamaca genellikle temiz sonuçları neden daha fazla protein sentezini önlemek için Siklohekzimidsiz varlığı yapılır. Burada detaylı olarak, kapsamlı bir analiz bazolateral sıralama yer alan düzenleyici proteinlerin izin sıcaklık vardiya de dahil olmak üzere polarize hücreler ve sonraki inkubasyon plazmid microinjecting prosedürü açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Bu makalede, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak polarize epitel hücreleri küçük GTPases aşırı ekspresyonu ve analiz yer alan usul.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...