Name: direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy
Uploaded: 2011-06-02T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لارس Philipsen للمساعدة في تحقيق الاستفادة المثلى من الأفلام intravital ، والدكتور جوناثان ليندكويست لقراءة المخطوطة بعناية ، وجميع أعضاء المختبر لاجراء مناقشات مفيدة Gunzer والتعليقات خلال تطوير الأسلوب. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG ، SFB 854) إلى MG

1. عدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتولد غبيرات منتفخة من العفن الرشاشية الدخناء (سلالة ATCC 46645) من مرحلة ما قبل الحضانة في RPMI 1640 (Biochrom AG ، برلين ، ألمانيا) تستكمل مع 5 ٪ FCS (V / V). ومعلق 2x10 7 غبيرات يستريح في المتوسط ​​5 مل والمحتضنة في صفيحة نسيج الثقافة جيدا 6 (TPP AG ؛ Trasadingen ، وسويسرا ، وأنواع # 92006) ل7H عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة وتورم ، وfluorescently المسمى الجراثيم وذلك بإضافة 10 ميكرولتر من محلول calcofluor الأسهم البيضاء (سيغما الدريتش ، Deisenhofen ، وألمانيا ، وأنواع # F3543 ؛ [25 ملغ / مل] في DMSO) إلى كل الرشاشية تحتوي كذلك في البئر - 6 لوحة ، والتوصل إلى تركيز calcofluor النهائية من 50 ميكروغرام / مل RPMI. بعد خلط لطيف ، والمحتضنة للجراثيم ل15 دقيقة اضافية في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الخطوة التالية ، ويتم حصاد الجراثيم عن طريق الترشيح من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، هايدلبرغ ، ألمانيا). بعد غسله مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مل 10 (الطرد المركزي في 900xg لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) هو معلق على بيليه في برنامج تلفزيوني مل (2) والعدد الإجمالي للغبيرات تورم يحددها العد مع غرفة نويباور. أخيرا هو نسج تعليق بوغ في اسفل 900xg لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ويتم إزالة بعناية طاف ، وبيليه معلق على التركيز النهائي للجراثيم 1x107 لكل 100 PBS ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للعدوى ، يتم تطبيق 100 ميكرولتر من محلول بوغ intratracheally في إناث الفئران (C57/BL6 ، 8-10 أسابيع من العمر ، هارلان ، ألمانيا). إذا العدلات هي التي يتعين مراعاتها كذلك ، فمن المستحسن استخدام ليز - EGFP الفئران ، تحمل EGFP تحت promotor الليزوزيم 1. يبدأ التخدير الحيوان مع حقنة واحدة من 150 IP حل Ketamin / Rompun ميكرولتر (Inresa Arzneimittel محدودة ، فرايبورغ ، ألمانيا (Ketamin) وباير محدودة الحيوية ، ليفركوزن ، ألمانيا (Rompun) ، 1 مل Ketamin [50 ملغ / مل] + 0.5 مل Rompun [2 ٪] + 3.5 مل العقيمة كلوريد الصوديوم [0.9 ٪]). يمكن 5 دقائق في وقت لاحق ان تكون ثابتة الماوس تخدير مع شريط مطاطي بواسطة أنيابها إلى المنحدر (أي سطح منحدر) لتسهيل التنبيب (تكميلية الشكل 1). باستخدام الملقط ، ويتم سحب اللسان لجانب واحد وريدي سكنى 22G القسطرة (B. براون AG ، Melsungen ، ألمانيا ، Vasofix Braunüle) يمكن إدراج برفق في القصبة الهوائية تحت إنارة دائمة مع أوزة مصباح العنق. يتم التحقق من الإدراج الناجح لقسطرة من خلال مراقبة حركة الصدر العادية للحيوان مع تواتر التنفس الصناعي الميكانيكي. عندما تم تأكيد التنبيب ناجحة ، يتم تطبيق وقف بوغ 100 ميكرولتر باستخدام micropipette 100 ميكرولتر. وينبغي أن استنشاق هذا الحجم من الحيوانات من دون أي مساعدة إضافية في 02/01 ثانية. وحققت زيادة توزيع الجسيمات داخل الفطرية الرئة التهوية ميكانيكيا الحيوانات المصابة لمدة 2 دقيقة مع جهاز للتنفس الحيوانات الصغيرة (MiniVent ، ساكس هوغو مارس Hugstetten ، ألمانيا) بسعر 250 نفسا في الدقيقة وحجم استنشاق 300 ميكرولتر في التنفس (تكميلية الشكل 2). بعد أن يتم إرجاع الحيوانات العدوى إلى القفص ، ويحتفل به كل 5 دقائق حتى المتنقلة مرة أخرى. الفئران لا تظهر أي دليل على الألم أو الضيق أثناء فترة الحضانة التالية. </li></ol> 2. إعداد الرئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 ساعة بعد الإصابة مع الجراثيم ، والموت الرحيم للحيوان عن طريق جرعة زائدة من isoflurane (باكستر محدودة ، Unterschleiβheim والمانيا) وحتى الحركات والتنفس قد توقف لأكثر من 30 ثانية. ثم تبعتها بذلك عن طريق بضع الصدر كأسلوب الثانوية لضمان موت سريري ، والسماح لتصور وصول القصبة الهوائية والرئتين. ثم يتم فتح الصدر بعناية لكشف سرطان الرئة والجهاز التنفسي العلوي. ثم يتم إدخال آخر ريدي سكنى 22G قسطرة في القصبة الهوائية بدءا من لسان المزمار المكشوفة. من خلال هذا نبيب يتم ملء الرئتين مع 1 مل من قبل agarose حرارة انصهار منخفضة (2 ٪ ث / ت ، Promega ، مانهايم ، ألمانيا) باستخدام حقنة 1 مل Omnifix (B. براون). حالما يتم ملء الرئتين والقصبة الهوائية قبالة تعادل مع قطعة قصيرة من خيوط الحياكة ويتم وضع كل الحيوانات في الثلاجة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 دقيقة في وقت لاحق ، عندما agarose وطدت ، يتم رفعه في الرئة بأكمله ابتداء من القصبة الهوائية. باستخدام مقص حاد وأشار ، في وقت لاحق يتم إزالة الفص الرئة اليمنى ، وتجفف لفترة وجيزة على السطح السفلي في ورقة الأنسجة ومن ثم يتم لصقها الفص بأكملها إلى كتلة إعداد Vibroslice vibratome 752M (Campden الآلات ، المملكة المتحدة ، ) باستخدام قطرة من مادة لاصقة لتثبيت الأنسجة (كارل روث محدودة ، كارلسروه ، ألمانيا ، روتي كول - 1). 1 دقيقة بعد تثبيت كتلة في مجلس النواب قطع من vibratome ، وهي مليئة قبل المبردة (4 درجات مئوية) في برنامج تلفزيوني. تم تعيين vibratome إلى اهتزاز متوسطة المدى (5 من أصل 10 كحد أقصى.) ، وكذلك سرعة معتدلة (5 من أصل 10 كحد أقصى.) بحيث شريحة الأفقي للويتم إنتاج الرئة. ثم نقل في النصف العلوي من الجهاز الى صحن صغير من البلاستيك بيتري (5 قطرها سم) حيث أنها مقلوب وثابتة مع غسالة عصامي شقة (1 سم القطر الداخلي) التي تغطيها مجموعة من خيوط النايلون بالتوازي مع ذلك ، كل 1 مم وبصرف النظر (الشكل التكميلي 3). أخيرا يملأ طبق بيتري مع 10 مل PBS تستكمل مع 10 ميكرولتر من الحمض النووي Sytox صبغ برتقالي [5 ملي] (Invitrogen ، ألمانيا) مما أدى إلى تركيز صبغة نهائية من 5 ميكرومتر. </li></ol> 3. 2 فوتون ليزر المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تثبيت الطبق بتري تحتوي على عينة الرئة تحت المجهر الهدف بحيث يمكن أن تكون درجة حرارة المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية من الحرارة أجهزة الاستشعار التي تسيطر عليها جهاز التدفئة (تكميلية الشكل 4). ويتم بعد ذلك 2 فوتون من المجهري على سطح قطع كامل باستخدام مجهر زايس LSM NLO 710 في مرحلة تستقيم ممتحن محوري مجهزة عدسة المياه 20xNA1.0 غمس (زايس ، جينا ، ألمانيا). التصوير ، ويتم مسح مناطق مختلفة على طول الباب وصولا الى عمق 400 ميكرون باستخدام الطول الموجي 800 نانومتر الإضاءة كشف الخضراء (530 نانومتر) والحمراء (580 نانومتر) مضان ، وكذلك الجيل الثاني التوافقي (SHG) ، وإشارة الزرقاء calcofluor مضان (400-470 نانومتر في الانبعاثات) مع عدم الكشف عن الخارجية descanned (NDD). 2 - D إلى جانب الصور والأفلام الفاصل الزمني (1 صورة كل ثانية 5-10) ، يمكن أن تكون مفردة أو متكررة مداخن صورة 3 الابعاد في وقت لاحق أصدرت واحدة أو الاداءات فوكسل الصور التركيز الموسعة أو 4 - D البيانات (3D مع مرور الوقت) باستخدام حزم البرمجيات المختلفة. يسمح هذا الإعداد مجهرية مراقبة السلوك الخلوية في بيئة سليمة تقريبا أنه ، كما أنه يشكل المنفذ دخول لمجموعة متنوعة من العوامل الممرضة المحمولة جوا ، وأمر له أهمية هائلة المناعية. يمكن حركية الخلية ، البلعمة والإنتاج NET بواسطة العدلات الذاتية بعد العدوى مع العفن الرشاشية الدخناء التحقيق بسهولة في ظل هذه الظروف في الوضع الطبيعي. </li></ol> 4. ممثل النتائج إذا كان ذلك صحيح فإن التصوير توليد 2 -- 3 أو لون الشرائح أو الأفلام. على الرغم من أن يتم التلوين في آخر إجراء معالجة وبالتالي فهي قابلة للتكيف بحرية ، ونحن عموما تحديد نظام التلوين الذي يعكس اللون الطبيعي للصباغة / إشارة ، والتي تم الكشف عنها في القناة النسبية. وهكذا ، وصفت في Sytox الأصباغ الحمراء ، الفطر ، وكذلك يظهر إشارة SHG باللون الأزرق ، وإذا كان حاضرا ، والملطخة EGFP الخلايا التي تحمل علامات باللون الأخضر. في المثال الأول (الشكل 1) إشارة SHG الزرقاء يصور ألياف أنسجة الرئة غير المصابة وينتج إشارة حمراء Sytox بواسطة نوى خلايا الرئة المقيم قطع مفتوحة من قبل vibratome. في المثال الثاني (الشكل 2) وأبدت الرئة المصابة ، على حد سواء حيث الهياكل والسنخية وكذلك الجماهير الفطرية ، وتظهر في الزرقاء ، في حين أن نواة الملون والشباك الحمراء. المثال الثالث (الشكل 3) هو من الحيوانات المعدلة وراثيا ، اليس EGFP حيث بالإضافة إلى هياكل الزرقاء والحمراء ويمكن أيضا أن ينظر العدلات الخضراء. يظهر هجرة العدلات والبلعمة بهم من العناصر الفردية الفطرية في متواليات الفاصل الزمني في الفيلم التكميلي. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. ظهور شريحة الرئة غير المصابة في اللون - 2 - 2 الفوتون المجهري. أعد شريحة من الرئة ماوس C57/BL6 غير المصابة وتصويره كما هو موضح في البروتوكول. قطع الإشارة Sytox نوى الخلايا المقدمة هنا هي إشارة SHG هيكل الأنسجة السنخية (A) ، وفتح أثناء إعداد شريحة الرئة (B) ، وتراكب للقناتين (C). وينظر الى المنطقة محاصر في (C) الموسع في (D). يرجى ملاحظة النسيج الليفي في الجزء السفلي من الرئة شريحة بالمقارنة مع منظمة السنخية بوضوح داخل المناطق النشطة في التنفس في الرئة أعلاه. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ظهور شريحة من الرئة المصابة الرشاشية نوع الحيوان البري في اللون - 2 - 2 الفوتون المجهري. شريحة من الرئة المصابة ماوس C57/BL6 7 ساعات قبل مع أ. وقد أعد الدخناء وتصوير كما هو موضح في البروتوكول. أظهرت هو هيكل مجتمعة الفطرية وSHG الأنسجة السنخية (A) ، وإشارة Sytox من الحمض النووي المستجدة فضلا عن نواة خلية قطع مفتوحة أثناء إعداد شريحة الرئة (B) ، وتراكب للقناتين (C) . وينظر الى المنطقة محاصر في (C) الموسع في (D). يرجى ملاحظة ، يتم وضع علامة على مجالات متميزة بوضوح الجماهير الفطرية والحويصلات الهوائية ، وهياكل - NET مع الأحرف F ، A و N ، على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. ظهور شريحة من رئة حيوان الرشاشية ليز - EGFP المصابة في اللون - 3 - 2 الفوتون المجهري. شريحة من الرئة ماوس اليس - EGFP المصابة قبل 7 ساعات معوقد أعد ألف الدخناء وتصوير كما هو موضح في البروتوكول. أظهرت هو هيكل مجتمعة الفطرية وSHG الأنسجة السنخية (الأزرق) ، وإشارة Sytox نوى الخلايا وشبكات (الحمراء) ، وكذلك فضلا عن العديد من العدلات (الخضراء). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="الشكل 4" /> تكميلية الشكل 1. تثبيت الماوس لالتنبيب وبموجب Ketamin / Rompun تخدير الحيوان هو ثابت مع شريط مطاطي على أنيابها ، من أجل تسهيل التنبيب مع القسطرة الوريدية سكنى 22G. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="الشكل 5" /> تكميلية الشكل 2. التهوية الميكانيكية الماوس. مصاب الماوس intubated بواسطة تطبيق ذلك من جراثيم 7 1x10 معلق تلفزيوني في 100 ميكرولتر. وحققت زيادة توزيع الجسيمات داخل الرئة الفطرية بواسطة التهوية ميكانيكيا الماوس مصابا تنفس الحيوانات الصغيرة. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 3 تكميلية. الفص تثبيت الرئة ، وبعد إعداد الفص الرئة اليمنى يتم إصلاح الجهاز في طبق بتري عن طريق استخدام غسالة شقة مختبر الصنع التي تغطي مجموعة من المواضيع من النايلون موازية. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="الشكل 6" /> تكميلية الشكل 4. 2 الفوتون الإعداد والتصوير ، ويجري تثبيت صحن بتري تحتوي على الفص الرئة اليمنى على حصيرة التدفئة تحت المجهر 2 فوتون بعد إضافة الحمض النووي Sytox الصبغة البرتقالية. الفيلم التكميلي : العدلات العدلات المهاجرة وphagocytosing عناصر فطرية في الرئتين الرشاشية المصابة من وجهة نظر الفاصل الزمني 2 - الفوتون المجهري لسرطان الرئة الذين يعيشون ح 7 شريحة بعد الإصابة مع الفطر والأخضر ، والعناصر الفطرية وSHG والأزرق ، ونواة الخلية و هي كذلك كما هو مبين في هياكل NET الحمراء. ويظهر في الوقت الحقيقي للتجربة في أسفل اليمين. شريط يصور حجم 50 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو</a>

<ol>
	<li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo.">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8(+)+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li><li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8(+)+T+cell+responses+in+lymph+nodes.">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li><li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores.">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li><li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation.">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li><li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis.">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li><li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li><li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities.">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li><li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA.">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li><li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation.">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li><li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li><li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

وقد اكتسبت في الوقت الحقيقي 2 - الفوتون المجهري في الجسم الحي أو في الأجهزة سليمة أهمية دراسات عميقة في التعامل مع علم وظائف الأعضاء من الخلايا المناعية على مدى السنوات ال 10 الماضية. كان مع هذا الأسلوب أن أحداثا هامة مثل ديناميات تي خلية التنشيط داخل الغدد الليمفاوية مرئية لأول مرة 2-4. في الآونة الأخيرة ، بدأ الباحثون أيضا إلى تحليل وظائف محددة مثل الخلوية الخطوات الأولى في توليد خلايا الأنسجة اللمفاوية المستجيب في استخدام هذا النهج 5. ومع ذلك ، وإن كانت قد كشفت عن وجود عدد من المفاهيم البيولوجية الجديدة باستخدام هذا الأسلوب ، لا تزال هناك تحديات والمسائل الهامة التي لم تنشر دراسات intravital التصور حتى الآن. وهذا ينطبق خصوصا على الرئة الثدييات. الجانب المثير في هذا الجهاز ، وميناء الدخول لمجموعة متنوعة من العوامل الممرضة المحمولة جوا ، ويجعل منها واحدة من أهم الأسطح التي تجري العمليات المناعية في الجسم الثدييات. مع كل نسمة على مدى الحياة بأكملها ، يتم استنشاق الجزيئات غير المرغوب فيها وبعضها لديها القدرة على إحداث العدوى 6 تهدد الحياة. انه غني عن الشرح أنه في مثل هذا الموقع الحساس والمهددة بالانقراض شبكة محكمة من آليات الدفاع يحتاج إلى أن تكون موجودة في معرض ذخيرة كاملة من الاستجابات المناعية. ومن ناحية أخرى فإنه من المهم جدا ان تخضع لرقابة صارمة الكفاح ضد مسببات الأمراض التي يسببها المناعية المحتملة في مثل هذا المكان &quot;القذرة&quot;. ردود فعل مبالغ فيه من الجهاز المناعي تحمل مخاطر عالية من الإضرار التي أصابت جسده على نطاق واسع على أنسجة الجهاز تحفيز الخلايا المناعية غير محددة الإجراءات 7،8. في ضوء هذه الأفكار سيكون من المهم للغاية ومفيدة لديها إمكانية للتحقيق في سلوك الخلايا في الرئتين الثدييات تحت ظروف حقيقية في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن مثل هذا النظام حتى الآن لم تنفذ بنجاح يشير بوضوح إلى الصعوبات الهائلة التي يتعين حلها في وضع بروتوكول للعمل. التحدي الأكثر تطلبا وربما الاستقرار التركيز. في الرئة والجهاز المسؤول عن التنفس تحت الحركة المستمرة في جميع الاتجاهات الثلاثة للفضاء لتحقيق الاستنشاق. هذا الظرف وحده يسبب مشاكل خطيرة التصوير ، ويمكن اعتبار intravital التصوير &quot;كابوس&quot;. بالفعل حركة طفيفة على أي البعد في الفضاء له تأثير هائل على الرأي القائل تدهور المجهرية ، والتي تحتاج إلى أن تكون مستقرة مع الدقة ميكرومتر من أجل توليد صور ذات مغزى 9. نظرا تركيزها ضيق بطبيعته المحلية 10 ، 2 الفوتون المجهري هو أكثر حساسية لعدم الاستقرار التنسيق ، كما خلع من بنية معينة في مجموعة من ميكرومتر قليلة في Z - الاتجاه هو ما يعادل خسارة كاملة من التركيز ، وبالتالي تجربة فاشلة. بروتوكول المعروضة في هذه الدراسة لرصد الخلايا المناعية في الرئة الفئران لا يزال ليس في التطبيق الجسم الحي ، وإنما هي تقريب وثيقا بالوضع في الرئة a سليمة وظيفيا 11. فيفو النهج السابق لمفاوي والتصوير ، وعلى سبيل المثال في الليمفاوية explanted وقد تبين أن العقد ، لتسفر عن نتائج حقيقية ما يعادل 12 في الملاحظات المجراة ، وبالتالي فهي ذات أهمية كبيرة 5. في الملاحظات على الموقع في شرائح الرئة ، والتي هي الوحيدة الممكنة مع نهجنا ، تجري في الرئة المصابة بعد وقت قصير من الختان. ويكفل سلامة 3D أثناء عملية القطع agarose المصفوفة ، وهي خطوة ضرورية للسماح لعملية قطع تسيطر على وجه التحديد في الرئة. على الرغم من أنه ضروري لتبريد الرئة explanted لفترة قصيرة للسماح للتصلب المصفوفة agarose ، فمن الممكن للعودة الى الظروف الفسيولوجية للخلايا القريب بعد إعادة التدفئة وقطع من النسيج. ويظهر ذلك بوضوح من خلال البيانات المتوفرة لدينا ، الأمر الذي يوضح أنه في ظل هذه الظروف العدلات نشطة للغاية ويحمل كامل إمكاناتهم والبالعات رشيقة ، والتي هي ضرورية لإزالة فعالة للعدوى الرشاشيات الدخناء. يقومون بدوريات على أنسجة الرئة التي تمر عبر الحواجز الظهارية من أجل الوصول إلى الأجزاء الداخلية من الحويصلات الهوائية ، وعلاوة على ذلك أنها تأخذ بنشاط الجراثيم الفطرية 11. وتمثلت النتيجة الرئيسية لهذا العمل ظهور هياكل تشبه الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات) في الجهاز الرشاشية المصابة. الحقائق المستجدة هي حديثة جدا لرواية آلية الدفاع في العدلات 13. ومع ذلك ، لأن الوصف الأولي في عام 2004 ، كان عدد من الشروط الفيزيولوجية المرضية أو في النماذج الحيوانية أو البشر حيث لوحظت هذه الظاهرة أو ينقص هو زيادة انفجارية 14-16. ومن المثير للاهتمام ، وإن كان قد أمضى الكثير من العمل على هذه الهياكل من قبل جماعات مختلفة كثيرة ، لا تزال معظم التقارير على المستوى الوصفي للغاية وليس كثيرامعروف عن آلية للإفراج NET ولائحته التنفيذية. مع بروتوكول لدينا تمكنا للمرة الأولى التي تظهر الألياف NET في الرئة المصابة. وعلاوة على ذلك ، فإننا لا يمكن التدليل على أهمية المعينين حديثا العدلات فضلا عن الهياكل الجزيئية لالفطرية وقوعها أو تثبيط 11. وهذا يدل بوضوح على احتمال اسلوبنا للتحقيق في واحدة من خطوات تشكيل NET بتفصيل أكبر. يمكن للمرء التفكير على سبيل المثال إلى استخدام العدلات من الفئران خروج المغلوب مناسبة لمراقبة قدرة على تشكيل NET في نقل التجارب بالتبني. وهكذا ، على الرغم من أن الملاحظة المباشرة للهجرة العدلات من الدم المحيطي غير ممكن مع هذا النظام نظرا لعدم وصول الدم بعد explantation الجهاز ، ونحن ما زلنا نعتقد أن لدينا بروتوكول هو نهج قيمة وسهلة نسبيا للتعامل مع هذا يتيح للتصوير في وقت مبكر أو متأخر الخطوات في الدفاع المناعي ضد الالتهابات الرئوية. هذا هو ، بالتالي ، خطوة هامة نحو تحقيق هذه الظاهرة داخل الرئة في التنفس الحيوانات الحية.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

بعد الجهاز الهضمي ، وسرطان الرئة هو السطح ثاني أكبر للتفاعل بين الفقاريات الجسم والبيئة. هنا ، يجب الحفاظ على تبادل الغاز فعالة ، بينما في الوقت ذاته على تجنب الإصابة من مسببات الأمراض المتعددة التي يتم استنشاقه أثناء التنفس الطبيعي. لتحقيق ذلك ، مجموعة رائعة من استراتيجيات الدفاع الجمع بين آليات المناعة الخلوية والخلطية موجودا. أحد التدابير الأكثر فعالية للدفاع حادة في الرئة هو توظيف للعدلات التي يبلعم إما استنشاق الجراثيم أو قتلهم عن طريق الإفراج عن المواد الكيميائية السامة للخلايا. وبالإضافة إلى ذلك مؤخرا إلى ترسانة من العدلات هو الافراج عنهم من المتفجرات المستجدة الحمض النووي خارج الخلية التي يمكن من خلالها اكتشاف البكتيريا أو الفطريات أو المعطل حتى بعد الافراج عن الخلايا NET لقوا حتفهم. نقدم هنا الأسلوب الذي يسمح احد لمراقبة مباشرة العدلات ، يهاجرون داخل الرئة المصابة مؤخرا ، مسببات الأمراض الفطرية phagocytosing كذلك تصور مثل المستجدة الواسعة التي كانت قد أنتجت في جميع أنحاء الأنسجة المصابة. ويصف طريقة تحضير شرائح سميكة الرئة قابلة للحياة بعد 7 ساعات من العدوى داخل الرغامى مع الفئران غبيرات من العفن الرشاشية الدخناء ودراستها من قبل المجهري متعدد الألوان 2 - الفوتون مرور الزمن. هذا النهج يسمح احد لتحقيق دفاع مضاد مباشرة في أنسجة الرئة الأصلية وبالتالي يفتح طريقا جديدا لتحقيق مفصل من الحصانة الرئوي.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy at JoVE.com

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

نظهر ، وكيفية استخدام 2 - الفوتون المجهري لمراقبة ديناميات المحببة العدلة في الرئتين المصابين وهم يبلعم مسببات الأمراض أو إنتاج الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات).

المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

التحديد الكمي في الوقت الحقيقي لأنواع الأكسجين التفاعلية في العدلات المصابة بالإشريشيا القولونية السحايا

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

التحقيق في البلعمة من الليشمانيا باستخدام المجهر البؤري

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...