Name: immunocytochemistry: human neural stem cells
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00
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<p> Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC e Dr. Gary Bassell da Universidade de Emory para a instrução inicial na técnica de coloração parafilme. </p>

<p class="jove_title"> Dia 1: Células Preparando Lamelas de vidro alemão e Seeding </p><p class="jove_content"> <em>Nota:</em> lamínulas alemães são muitas vezes preferível para cultura primária de células-tronco neurais e neurônios. Nós usamos o protocolo de limpeza a seguir para melhorar a adesão celular e se espalhando. Lamínulas posição em um rack pequeno que permitirá o acesso líquido para ambos os lados da lamela. Primeiro, lamínulas incubar em Liquinox 1% por 10 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Certif...

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	<li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A,+the+Arp2/3+complex,+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells.">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> <em style='font-style: italic'>J. Cell Biol</em>. <b>155</b>, 511-518 (2001).</li><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins.">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> <em style='font-style: italic'>J. Neurosci. Res</em>. <b>83</b>, 845-856 (2006).</li><li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells.">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide</em>. , (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+Human+Neural+Stem+Cells.">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Visualized Experiments</em>. <b>7</b>, (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+Human+Neural+Stem+Cells.">Counting Human Neural Stem Cells.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Visualized Experiments</em>. <b>7</b>, (2007).</li></ol>

<p> Este protocolo descreve um procedimento de imunomarcação para hNSPCs que minimiza o volume de anticorpos necessário e dá coloração celular confiável. O procedimento descrito é o melhor para os antígenos intracelulares, mas podem ser modificados para mancha moléculas de superfície celular ou para melhorar a coloração do citoesqueleto. </p>

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips</td>
<td>Tool</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>WW-63-3029</td>
<td>12,15,18, 22, 25 mm coverslips available</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquinox phosphate-free detergent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z273279</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, natural mouse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EMEM (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>MT-10-010-CV</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151-500</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin, IgG-free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immunoresearch</td>
<td>001-000-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>H-1399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>viscous</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>
		

immunocytochemistry: human neural stem cells

<p class="jove_content"> Imunocitoquímica é um método muito poderoso e bastante simples para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse, geralmente uma proteína, em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de passos que vai permitir aos investigadores para conservar anticorpos primário e secundário ao obter alta qualidade, reprodutíveis e qualitativa de dados quantitativos de sua coloração. Há dois aspectos deste protocolo, que contribuirá para a conservação do volume de anticorpos necessário para a coloração. Por um lado, as células são cultivadas em pequenas, lamínulas circulares que são colocados em poços de uma placa de cultura de tecidos. Após a fixação, as células em lamínulas podem ser removidos dos poços da placa. Para a coloração de anticorpos, as lamelas com células é invertido em uma pequena gota de solução anticorpo em parafilme e é coberta com um segundo pedaço de parafilme para evitar a secagem. Usando este método, apenas ~ 25 ml de solução de anticorpo é necessária para cada lamela (ou amostra) a ser manchada. Este protocolo descreve imunocoloração de-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas pode ser usado para muitos outros tipos celulares. </p>

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Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

<p class="jove_content">Imunocitoquímica é um poderoso método para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de medidas que permitirão uma anticorpos para conservar e tirar o máximo proveito da própria coloração.</p>

Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

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Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

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Contando células-tronco neurais

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

Passaging células-tronco neurais

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...