Name: dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00
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Ringraziamo il Dott. Nael Alami e il Dr. Nam Chul Kim per i loro utili commenti su questo manoscritto.

1. Preparazione per Immunofluorescenza: <ol><li> Per creare una superficie dissezione, versare Sylgard 184 Base elastomeri di silicone in un piatto piccolo coltura di tessuti. Fare attenzione a non riempire completamente la piastra in modo che l&#39;area dissezione è più basso del cerchio. </li><li> Trim pin dissezione, per una lunghezza di circa 3,5 mm per una maggiore facilità di manipolazione, e assicuratevi di avere almeno 6 pin per ogni larva. </li><li> Avrete bisogno di forcipe smussato che permetterà di cog...

<ol>
	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Per i neuroni, la zona terminale sinaptico è di fondamentale importanza, ed è il ponte per una corretta comunicazione tra il post-e pre-sinaptici delle cellule. Un modo efficace per studiare la salute del neurone in modelli di malattia è quello di analizzare le proteine ​​del terminale sinaptico mediante immunofluorescenza. Il metodo di immunofluorescenza qui presentata consente al ricercatore di esaminare le larve di molti contemporaneamente, limitando le differenze ambientali tra i gruppi. Il sistema nervoso ce...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base in silicone elastomero </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Dopo la miscelazione permettono di bolle a salire lentamente mettendo su dei rotatori lenti o che consentono di sedersi per 30 minuti o più. </td></tr><tr><td> Acciaio Minutien Pins </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26002-10 </td><td> Tagliare a ca. 3-4mm di lunghezza con le forbici normali </td></tr><tr><td> Pinze laminectomia (Blunt-Usato per afferrare pin) </td><td> Strumenti di Scienze multa </td><td> 11223-20 </td><td> Usa come pinze per afferrare smussato perni </td></tr><tr><td> Pinza dissezione </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs SuperFine Forbici, 8cm lunghi </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-Brp anticorpi </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Usa diluizione 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 Affinipure capra anti-perossidasi di rafano </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Uso a 1:200 diluizione </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Usa ca. Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

Le larve di Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) è un modello eccellente per lo studio della struttura e della funzione sinaptica. Drosophila è ben noto per la facilità di potenti manipolazioni genetiche e il sistema nervoso larvale è dimostrata particolarmente utile per studiare non solo la normale funzione ma anche perturbazioni che accompagnano una malattia neurologica (Lloyd e Taylor, 2010). Molte molecole chiave sinaptica si trovano in Drosophila sono presenti anche nei mammiferi e come la maggior parte delle sinapsi eccitatorie sistema nervoso centrale nei mammiferi, la NMJ Drosophila è glutammatergica e dimostra attività-dipendente rimodellamento (Koh et al., 2000). Inoltre, i neuroni Drosophila possano essere identificati individualmente, perché i loro modelli di innervazione sono stereotipati e ripetitivi che consente di studio ha identificato i terminali sinaptici, come quelle tra i neuroni motori e il corpo-muro fibre muscolari che innervano (Keshishian e Kim, 2004). L&#39;esistenza di componenti sinapsi evolutivamente conservata insieme alla facilità di manipolazione genetica e fisica del modello Drosophila ideale per lo studio dei meccanismi alla base della funzione sinaptica (Budnik, 1996). Le zone attive ai terminali sinaptici sono di particolare interesse perché questi sono i luoghi di rilascio dei neurotrasmettitori. NC82 è un anticorpo monoclonale che riconosce la proteina Bruchpilot Drosophila (BRP), un membro della famiglia CAST1/ERC che è una componente importante della zona attiva (Wagh et al., 2006). BRP ha dimostrato di forma direttamente la zona attiva T-bar ed è responsabile in modo efficace il clustering Ca 2 + canali sotto la T-bar densità (Fouquet et al., 2009). Mutanti di BRP hanno ridotto Ca 2 + densità di canali, depresso rilascio delle vescicole evocato, e modificato a breve termine plasticità (Kittel et al., 2006). Alterazioni zone attive sono state osservate in modelli di malattia Drosophila. Per esempio, immunofluorescenza utilizzando l&#39;anticorpo NC82 ha mostrato che la densità zona attiva è stata ridotta in modelli di sclerosi laterale amiotrofica e la sindrome di Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009.). Quindi, la valutazione delle zone attive, o altre proteine ​​sinaptiche, in modelli larve di Drosophila malattia può fornire un indizio prezioso iniziale per la presenza di un difetto sinaptica. Preparare tutto il montaggio larve sezionato Drosophila per l&#39;analisi di immunofluorescenza del NMJ richiede una certa abilità, ma può essere realizzato dalla maggior parte degli scienziati con un po &#39;di pratica. Presentato è un metodo che prevede le larve più per essere sezionati e immunostained nel piatto dissezione stessa, limitando le differenze ambientali tra ciascun genotipo e fornendo animali sufficiente per la fiducia nella riproducibilità e analisi statistiche.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

La giunzione neuromuscolare (NMJ) di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; È un sistema importante modello per lo studio normale funzione sinaptica e perturbazioni a funzione sinaptica si trovano in alcune malattie neurologiche. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale motore del sistema e immunocolorazione per le proteine ​​all&#39;interno della zona attiva NMJ.

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

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Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

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