Name: transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00
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pCAG - gapEGFP 플라스미드 박사 S. 맥코넬 (스탠포드, CA)에서 선물했다. pCAG - tdTomato 플라스미드 박사 M. 펠러 (버클리, CA)에서 선물했다. 우리는 기술 지원을위한 시험 연구와 Crair 연구소 회원에 두 개의 플라스미드 Cre 호텔 / loxP 전략을 검증을위한 단일 셀 라벨 앤 Schohl (몬트리올, QC)에 대한 두 플라스미드 전략의 사용을 제안 박사의 에드워드 Ruthazer 감사합니다. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC)와 NIH P30 EY000785 (MC) 지원.

1. 설정 Electroporation을위한 장비 <ol><li> 전극 : 우리는 더몬트에게 전극으로 사용하기 # 5 포셉을 수정했습니다. <ol><li> 분리와 포셉을 따로 휴식. </li><li> 각 단자의 넓은 끝에 솔더 와이어. 전선 연결 및 절연 테이프와 접지 단자가 노출 접지 단자의 끝에 약 25~30밀리미터 떠나을 바꿈. </li><li> 스프링 동작을 제공하기 위해 두 접지 단자 사이에 적당한 플라스틱 스페이서 (예 : 단추)와 다시 함...

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

이 비디오에서 우리는 생체내의 electroporation 프로토콜에을 입증되는 형광 단백질을 인코딩 DNA 구조와 출생 후의 생쥐의 망막 뉴런의 단일 또는 작은 클러스터의 라벨을 초래합니다. 이전 연구 그 electroporation 정상 RGC 축삭 아버 상세 검색을 방해하지 않았 의미, lipophilic 염료와 RGC 라벨을 사용하는 것과 dLGN와 SC에 찬란 분류 RGC 예측의 작은 클러스터는 유사한 프로젝션 패턴을 재현. ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 자료 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 더몬트 # 5 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> 전기 자극기 </td><td> 그라스 악기 </td><td> 모델 S4 </td></tr><tr><td> 오실로 스코프 </td><td> 애질런트 </td><td> 모델 54621A </td></tr><tr><td> 오디오 모니터 </td><td> 그라스 악기 </td><td> 모델 AM8B </td></tr><tr><td> 끌어당기는 것 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 P - 97 </td></tr><tr><td> Vannas 가위 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,003 </td></tr><tr><td> 마이크로 가위 B </td><td> 테드 펠라 </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> 더몬트 AA 집게 C </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> II 시스템 Nanoinject </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> 유리 Pipettes </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3 - 000-203 - G / X </td></tr><tr><td> 풋 페달 </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D - 383 </td></tr><tr><td> N, N - Dimethylformamide </td><td> 시그마 </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

midbrain에 RGC 예측의 대상 및 개선 개발하는 동안 신경 연결 양식의 방법은 정확한 패턴을 공부에 대한 인기있는 강력한 모델 시스템입니다. 생쥐에서 retinofugal 전망은 시상 및 우수 Colliculus (SC)의 래터럴 Geniculate 핵의 지형 방식과 양식 눈 특정 레이어 (dLGN)에 정렬됩니다. retinofugal 예측 이러한 정확한 패턴의 개발은 일반적으로 같은 양고추냉이 퍼옥시데이즈 1-4로 형광 염료와 추적기와 RGCs의 인구를 분류하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 retinotopic지도 형성의 기초있는 개별 RGC axonal 아버 형태의 발달 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 너무 거칠어. 또한 RGCs의 유전자 조작에 대한 허용하지 않습니다. 최근 electroporation은 망막 5-11로 청구 분자의 제공을위한 정확한 공간과 시간적 제어를 제공하는 효과적인 방법이되었다. 현재 망막 electroporation 프로토콜은 유전자 조작을 허용하고 출생 후의 생쥐에 RGCs의 단일 또는 작은 클러스터의 retinofugal 예측을 추적하지 않습니다. 그것은 생체내의 electroporation에 출생 후의이 상표 효율이 매우 낮은이기 때문에 RGCs를 transfecting위한 가능한 방법이 아니므로 그러므로 RGC progenitors가 분화 및 증식 6 겪고 아르 배아 연령 타겟팅에 필요하다는 주장했습니다. 이 비디오에서 우리는 타겟 유전자의 전달, shRNA, 및 postnatally murine RGCs에 형광 dextrans에 대한 생체내의 electroporation 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 분기, 라미네이션, 재생 및 회로 개발의 다양한 단계에서 버렸네 형성, 축삭의 철회를 포함한 신경 발달의 여러 측면에 관련된 후보 유전자의 효율적인 심사를위한 빠르고 효율적인 비용과 상대적으로 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 요약 우리는 여기에 감각지도 개발을 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것입니다 가치있는 도구를 설명합니다.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

우리는를 보여<em&gt; 생체내에</em망막 신경절 세포 (RGCs)과 연령대의 넓은 범위에서 출생 후의 생쥐의 다른 망막 세포 유형의 단일 또는 소규모 클러스터를 transfecting위한&gt; electroporation 프로토콜. 라벨과 유전 출생 후의 RGCs를 조작하는 능력<em&gt; 생체내에</em&gt; 발달 연구를위한 강력한 도구입니다.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

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마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

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광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

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성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...