Name: a &#946;-glucuronidase (gus) based cell death assay
Uploaded: 2011-05-06T15:00:00
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Nicotiana benthamiana Pflanzen werden in einem temperierten Klimakammer bei 25 ° C gewachsen. Voll ausgebaut gesunde Blätter von 3-6 Wochen alten Pflanzen verwendet werden. Tipp: Bessere Ergebnisse werden mit neu entstehenden Blättern gewonnen 1. Agrobacterium vorübergehende Infiltration Protokoll: Tag 1 <ol><li> Streak LB / Rifampicin (25 ug / ml) / Kanamycin (100 ug / ml) Agarplatten mit Glycerin Aktien von Agrobacterium...

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	<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUS+fusions:+,+&#946;-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">GUS fusions: , &#946;-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).</li><li>Nishihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+&#946;-Glucuronidase+Gene+in+Pollen+of+Lily+(Lilium+longiflorum),+Tobacco+(Nicotiana+tabacum),+Nicotiana+rustica,+and+Peony+(Paeonia+lactiflora)+by+Particle+Bombardment.">Expression of the &#946;-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment.</a> Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).</li><li>Hodal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Science. 87, 115-115 (1992).</li><li>Kabbage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAG+proteins:+a+ubiquitous+family+of+chaperone+regulators.">The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators.</a> Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).</li><li>Kang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtBAG6,+a+novel+calmodulin-binding+protein,+induces+programmed+cell+death+in+yeast+and+plants.">AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants.</a> Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).</li><li>Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).</li><li>Takayama, S., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+targeting+and+regulation+by+BAG+family+proteins.">Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins.</a> Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).</li><li>Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+BAG-1:+a+novel+Bcl-2-binding+protein+with+anti-cell+death+activity.">Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity.</a> Cell. 80 (2), 279-279 (1995).</li><li>Vitha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+&#946;-glucuronidase+assay+in+transgenic+plants.">Quantitative &#946;-glucuronidase assay in transgenic plants.</a> Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).</li><li>Otha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Expression+in+Tobacco+of+a+&#946;-Glucuronidase+(GUS)+Reporter+Gene+Containing+an+Intron+Within+the+Coding+Sequence.">Construction and Expression in Tobacco of a &#946;-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence.</a> Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Es ist oft schwierig, den Zelltod Nachweisverfahren in Pflanzen, die häufig in Säugetier-Systemen verwenden. In Kombination mit einem GUS-Reporter-System präsentieren wir ein auf pflanzlicher Basis, empfindliche Methode zum Nachweis und zur Analyse von Zelltod Spieler. Diese Methode nutzt die Tatsache, dass lebende Zellen für GUS-Expression auftreten, sind erforderlich. Um sicherzustellen, aussagekräftige Ergebnisse und Wiederholbarkeit, ist es entscheidend, dass die Kulturen beherbergen die GUS-Kassette und das...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Rifampicin </td><td> VWR </td><td> IC19549001 </td><td> 25mg/ml Lager in DMSO </td></tr><tr><td> 4&#39;-Hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-Dimethoxyacetophenon (Acetosyringon) </td><td> VWR </td><td> TCD2666 </td><td> 0,981 g / mL in DMSO (1M Lager) </td></tr><tr><td> 2 - (4-Morpholino) ethansulfonsäure Monohydrat (MES) </td><td> VWR </td><td> EM-6110 </td><td> 1,92 g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L der Infiltration Medien </td></tr><tr><td> Bacto-Trypton </td><td> Fischer </td><td> BP1421-2 </td><td> 10g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L LB-Medium </td></tr><tr><td> Bacto-Hefeextrakt </td><td> VWR </td><td> EM1.03753.0500 </td><td> 5g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L LB-Medium </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> VWR </td><td> EM-7710 </td><td> 10g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L LB-Medium </td></tr><tr><td> Mononatriumphosphat Monohydrat </td><td> VWR </td><td> MK-7868 bis 12 </td><td> 2,5 g / L in Wasser zur Herstellung von 50mm Puffer NaPi </td></tr><tr><td> Natriumdihydrogenphosphat Heptahydrat </td><td> VWR </td><td> EMD-SX0715-1 </td><td> 5g / L in Wasser zur Herstellung von 50mm Puffer NaPi </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfatheptahydrat </td><td> VWR </td><td> EM-MX0070-1 </td><td> 2,5 g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L der Infiltration Medien </td></tr><tr><td> N-Lauroylsarcosin </td><td> VWR </td><td> TCL0151-500G </td><td> 0,1% v / v in GUS-Puffer </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-Chlor-3-Indoxyl-beta-D-Glucuronid Cyclohexylammoniumsalz (X-Gluc) </td><td> Gold-Biotechnologie </td><td> G1281C </td><td> 1mg/100uL in Methanol 100% </td></tr><tr><td> 4-Methyl-μ-D-Glucuronid-Hydrat (MUG) </td><td> Sigma </td><td> M5664 </td><td> 2 mM in 100 uL der GUS-Extraktionspuffer </td></tr><tr><td> Kaliumferrocyanid Trihydrat </td><td> VWR </td><td> EM-PX1460-1 </td><td> 100 mM Stammlösung für X-Gluc Substrat-Lösung </td></tr><tr><td> β-Methylumbelliferon (MU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1381 </td><td> Für MU Standardkurve verwenden GUS-Extraktionspuffer </td></tr><tr><td> Natriumcarbonat </td><td> VWR </td><td> EM-SX0395-11 </td><td> 0,2 M in Wasser zur Herstellung von GUS Anschlagpuffer </td></tr></tbody></table>

a &#946;-glucuronidase (gus) based cell death assay

Wir haben eine neue vorübergehende Anlage Ausdruck System, das gleichzeitig Ausdruck der Reportergen β-Glucuronidase (GUS), mit vermeintlichen positive oder negative Regulatoren des Zelltods entwickelt. In diesem System, N. benthamiana Blätter sind mit einer 35S angetrieben Expressionskassette enthält das Gen analysiert werden co-infiltriert, und die GUS-Vektor pCAMBIA 2301 unter Verwendung von Agrobacterium LBA4404 als Vehikel. Da lebende Zellen benötigt werden für die GUS-Expression auftritt, ist der Verlust der GUS-Aktivität zu erwarten, wenn dieses Markergen wird mit positiven Regulatoren des Zelltods co-exprimiert. Ebenso erhöhte GUS-Aktivität beobachtet wird, wenn anti-apoptotischen Gene im Vergleich zu den Vektor-Steuerung verwendet werden. Wie unten gezeigt, haben wir erfolgreich dieses System in unserem Labor verwendet, um sowohl pro-und anti-death-Spieler zu analysieren. Dazu gehören die Anlage anti-apoptotischen Bcl-2 assoziierte athanoGene (BAG) Familie, sowie bekannte Säugetier-Induktoren von Zelltod, wie BAX. Darüber hinaus haben wir dieses System verwendet, um den Tod in Abhängigkeit von bestimmten Verkürzungen innerhalb Proteinen, die Hinweise auf die mögliche posttranslationale Modifikation / Aktivierung dieser Proteine ​​könnte zu analysieren. Hier präsentieren wir eine schnelle und empfindliche Pflanzen basierende Methode, als einen ersten Schritt bei der Untersuchung des Todes Funktion bestimmter Gene.

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A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Der programmierte Zelltod-Assays häufig in Säugetier-Systemen wie DNA laddering oder TUNEL-Assays, sind oft nur schwer in Pflanzen zu reproduzieren. In Kombination mit einem GUS-Reporter-Systems, schlagen wir eine schnelle, auf pflanzlicher Basis transienten Assay, um das Potenzial der Tod Eigenschaften bestimmter Gene zu analysieren.

Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Research

JoVE Journal

Biology

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Forschung

Biologie

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Der mikroskopiebasierte Assay zur Untersuchung und Analyse der Recycling-Endosomen mittels SNARE-Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

Histologische Grundlagen und Zelltodnachweis in Honigbienengewebe

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G und einem In-vitro-Spontantod-Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...