Name: photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire Meshorer, surtout Shai Melcer, Adi Alajem, Raghu Ram Edupuganti, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout et Alva Biran, pour les commentaires critiques et pour le dépannage des expériences de photoblanchiment sur une base quotidienne. EM est un H. Joseph et Belle R. Braun Senior Lecturer en Sciences de la Vie et est soutenu par la Fondation des sciences d&#39;Israël (ISF 943/09), le ministère israélien de la Santé (6007) de l&#39;Union européenne (IRG-206872 et 238176), l&#39;Israel Cancer Research Foundation, l&#39;interne Applicative Subventions de médecine de l&#39;Université hébraïque et de la psychobiologie Institut israélien.

1. Placage des cellules ES T = 0 h Plaquage MEF <ol><li> Manteau de l&#39;imagerie direct 8-même μ-Slides (ibidi; Munich, Allemagne) avec la gélatine ou dans des verres à couvercle chambrés (Lab-Tek; Rochester, NY) ou en boîtes de culture à fond de verre (MatTek; Ashland, MA). Départ pour 5-30 min et aspirer l&#39;écart de la gélatine sans. </li><li> Graine 22000 FAE / puits dans 250 ul volume total de DMEM [complété avec 10% sérum de veau fœtal (FBS)]. Permettent aux cel...

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

Contrairement à la plupart des techniques disponibles, qui impliquent la chromatine purifiée à partir de populations de cellules ou de cellules fixes, des expériences FRAP suivre l&#39;évolution de la dynamique des protéines de la chromatine dans les cellules vivantes. Nous avons trouvé la dynamique des protéines de chromatine d&#39;être un bon indicateur de la plasticité chromatinienne. Cependant, parce qu&#39;il exige la fusion des gènes d&#39;intérêt avec la GFP, l&#39;ajout du marqueur fluorescent peut ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-même μ-Slides </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) permettra l&#39;étude de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes avec une résolution spatiale et temporelle bien. Nous décrivons ici comment effectuer FRAP et FLIP dosages des protéines de la chromatine, notamment H1 et HP1, chez la souris souches embryonnaires (ES) cellules. Dans une expérience de FRAP, les cellules sont transfectées, soit transitoire ou stable, avec une protéine d&#39;intérêt fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou leurs dérivés (YFP, CFP, cerise, etc.) Dans le transfectées, les cellules fluorescentes, un faisceau laser intense concentré blanchit une région relativement petite d&#39;intérêt (ROI). La longueur d&#39;onde laser est choisie en fonction de la protéine fluorescente utilisée pour la fusion. La lumière du laser blanchit de manière irréversible le signal de fluorescence des molécules dans le retour sur investissement et, immédiatement après le blanchiment, la récupération du signal fluorescent dans la zone blanchie - médiatisé par le remplacement des molécules blanchie avec les molécules non blanchie - est contrôlée au moyen d&#39;imagerie laps de temps. Les courbes générées récupération de fluorescence fournir des informations sur la mobilité de la protéine. Si les molécules fluorescentes sont immobiles, aucune récupération de fluorescence est observée. Dans une approche complémentaire, la perte de fluorescence dans le Photobleaching (FLIP), le faisceau laser blanchit au même endroit à plusieurs reprises et l&#39;intensité du signal est mesuré ailleurs dans la cellule fluorescente. Expériences FLIP donc mesurer la carie signal plutôt que la récupération de fluorescence et sont utiles pour déterminer la mobilité des protéines ainsi que la protéine navette entre compartiments cellulaires. Contraignante transitoire est une propriété commune de la chromatine protéines associées. Bien que la fraction majeure de chaque protéine chromatine est lié à la chromatine à tout moment à l&#39;état stationnaire, la liaison est transitoire et la plupart des protéines de chromatine ont un chiffre d&#39;affaires élevé sur la chromatine, avec un temps de séjour dans l&#39;ordre des secondes. Ces propriétés sont cruciales pour générer une grande plasticité dans l&#39;expression du génome 1. Expériences de photoblanchiment sont donc particulièrement utiles pour déterminer la plasticité chromatinienne utilisant la GFP-fusion des versions de la chromatine des protéines structurelles, en particulier dans les cellules ES, où l&#39;échange dynamique de protéines de chromatine (y compris les protéines hétérochromatine 1 (HP1), un linker histone H1 et histones) est plus élevé que dans les cellules différenciées 2,3.

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Nous décrivons les méthodes de récupération, y compris photoblanchiment de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) pour suivre la dynamique des protéines dans la chromatine souches embryonnaires (ES) cellules. La dynamique des protéines de la chromatine, ce qui est considéré comme l&#39;un des moyens d&#39;étudier la plasticité de la chromatine, est augmentée dans les cellules pluripotentes.

Photobleaching essais (FRAP et FLIP) pour mesurer la dynamique des protéines de la chromatine dans Vivre cellules souches embryonnaires

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Recherche

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Modélisation des cellules souches embryonnaires utilisant la puce Bio Retourner

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

L&#39;utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...