Name: photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00
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私たちは、批判的なコメントのためにと日常的にトラブルシューティング退色実験のため、特にMeshorer研究室のメンバーは、シャイMelcer、アディAlajem、Edupugantiラグーラム、バディスリランカSailaja、アンナMattoutとアルバBiranに感謝。 EMは、ジョセフH.とベルR.ブラウンライフサイエンスの上級講師であり、イスラエル科学財団（ISF 943/09）、保健イスラエル省（6007）欧州連合（IRG - 206872および238176）でサポートされていますイスラエル癌研究財団、ヘブライ大学、イスラエルの精神生物学研究所の内部実用的な医療補助。

1。 ES細胞をめっき T = 0時間 MEFのメッキ<ol><li>コー​​トライブイメージングμ-スライド8ウェル（ibidi、ミュンヘン、ドイツ）ゼラチンまたはチャンバーカバーガラスで（ラボ- Tek社、ロチェスター、ニューヨーク州）とやガラス底培養皿で（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）。 5〜30分放置し、遊離ゼラチンを離れて吸引除去する。 </li><li>シード2200...

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	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

細胞集団または固定化細胞、FRAP実験から精製されたクロマチンを含むほとんどの利用できる技術とは異なり、生きた細胞のクロマチン蛋白質のダイナミクスの変化に従ってください。我々はクロマチンの蛋白質のダイナミクスは、クロマチン可塑性の良い指標であることが判明。しかし、それは融合のGFPと目的の遺伝子を必要とするため、蛍光タグを追加するには、タンパク質の機能を妨げ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> DMEM </td><td>シグマ</td><td> D5671 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>メルク</td><td> 1.04078 </td></tr><tr><td>のOpti - MEM </td><td>ギブコ</td><td> 31985 </td></tr><tr><td>トランジット- LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> μ-スライド8ウェル</td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

光退色後蛍光回復（FRAP）や光退色で蛍光損失（FLIP）が良好な空間分解能と時間分解能を持つ生体細胞内の蛋白質のダイナミクスの研究を可能にします。ここでは、FRAP及びマウス胚性幹（ES）細胞のH1とHP1、を含む、クロマチンタンパク質のFLIPアッセイを、実行する方法について説明します。 FRAP実験で、細胞は緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその誘導体（YFP、CFP、チェリー、など）を融合させた目的のタンパク質で、どちらか一過性または安定的に、トランスフェクトされています。トランスフェクト、蛍光細胞では、強烈な焦点レーザービームは、興味の比較的小さい領域（ROI）を漂白剤。レーザーの波長は、融合に使用する蛍光蛋白質に応じて選択されます。レーザー光が不可逆的にROI内の分子の蛍光シグナルを漂白剤と、すぐに漂白以下、漂白地域における蛍光シグナルの回復 - 無漂白の分子と漂白分子の交換によって媒介は - タイムラプスイメージングを使用して監視されます。生成された蛍光回復曲線は、タンパク質の流動性に関する情報を提供しています。蛍光分子が不動であれば、何蛍光回復は観察されません。補完的なアプローチでは、光退色における蛍光損失（FLIP）は、レーザービームは、繰り返し同じ場所を漂白し、信号強度は、他の場所で蛍光を発する細胞で測定されます。 FLIPの実験では、したがって、信号の減衰ではなく、蛍光の回復を測定し、タンパク質の移動度と同様に細胞区画を行き来し蛋白質を決定するのに便利です。一時的な結合は、クロマチン関連タンパク質の一般的なプロパティです。各クロマチン蛋白質の主要な割合が定常状態での任意の時点でクロマチンにバインドされていますが、バインディングは一時的であり、ほとんどのクロマチンタンパク質は、秒の順番で滞留時間で、クロマチン上で高い離職率を持っている。これらのプロパティは、ゲノムの式1に高い可塑性を発生させるために重要です。退色実験は、特にクロマチンタンパク質の動的な交換が（ヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）、リンカーヒストンH1とコアヒストンを含む）以上であるES細胞、で、それゆえクロマチン構造蛋白質のGFP融合バージョンを使用してクロマチン可塑性を決定するために特に有用です。 2,3分化細胞に比べて。

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Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

我々は、光退色後蛍光回復（FRAP）や胚性幹（ES）細胞におけるクロマチン蛋白質の動態を監視する（FLIP）光退色で蛍光の損失を含む光退色の方法を説明します。クロマチン可塑性を研究する手段の一つであると考えられているクロマチン蛋白質のダイナミクスは、多能性細胞で強化されています。

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

生物学

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

バイオフリップチップを用いた胚性幹細胞のパターニング

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞を凍結融解

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用した<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;成長円錐

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...