Name: photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Agradecemos a membros do laboratório Meshorer, especialmente Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout e Alva Biran, por comentários críticos e para a resolução de problemas experimentos fotobranqueamento em uma base diária. EM é um H. José e Belle R. Braun Professor de Ciências da Vida e é apoiado pela Fundação Ciência Israel (ISF 943/09), o Ministério da Saúde, Israel (6007) da União Europeia (IRG-206872 e 238176), Israel Cancer Research Foundation, o Internal Applicative Grants de Medicina da Universidade Hebraica e do Instituto de Psicobiologia Israel.

1. Chapeamento as células ES T = 0 hrs Plating MEF <ol><li> Brasão da imagem live 8 bem-μ-Slides (ibidi; Munique, Alemanha) com gelatina ou em copos chambered tampa (Lab-Tek, Rochester, NY) ou em pratos de vidro de fundo de cultura (Mattek; Ashland, MA). Deixe por 50-30 min e aspire a gelatina de distância livre. </li><li> Semente 22.000 MEFs / poço em 250 mL de volume total de DMEM [suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS)]. Permitem que as células a crescer em uma cultura d...

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

Ao contrário das técnicas mais disponíveis, que envolvem cromatina purificada a partir de populações de células ou células fixas, experimentos FRAP seguir as mudanças na dinâmica de proteínas da cromatina em células vivas. Encontramos dinâmica de proteínas da cromatina para ser um bom indicador para a plasticidade da cromatina. No entanto, porque requer a fusão do gene de interesse com GFP, a adição da tag fluorescentes podem interferir com a função da proteína. Assim, antes de prosseguir com FRAP, a ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Trânsito LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-bem-μ Slides </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) permitem o estudo da dinâmica de proteínas em células vivas, com resolução espacial e temporal bem. Aqui nós descrevemos como executar FRAP e ensaios FLIP de proteínas da cromatina, incluindo H1 e HP1, em tronco embrionárias de camundongos (ES) células. Em um experimento FRAP, as células são transfectadas, seja transitoriamente ou de maneira estável, com uma proteína de interesse em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP) e suas derivadas (YFP, PCP, Cherry, etc.) No transfectadas, as células fluorescentes, um feixe de laser intenso focado alvejantes uma região relativamente pequena de interesse (ROI). O comprimento de onda do laser é selecionado de acordo com a proteína fluorescente usada para a fusão. A luz do laser de forma irreversível o sinal alvejantes fluorescentes de moléculas no ROI e, imediatamente após o branqueamento, a recuperação do sinal fluorescente na área branqueada - mediada pela substituição das moléculas branqueada com as moléculas crus - é monitorado usando imagens de lapso de tempo. Gerada curvas de recuperação de fluorescência fornecer informações sobre a mobilidade da proteína. Se as moléculas fluorescentes são imóveis, nenhuma recuperação de fluorescência será observado. Em uma abordagem complementar, perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP), o feixe de laser alvejantes mesmo lugar repetidamente e da intensidade do sinal é medido em outras partes da célula fluorescentes. Experimentos FLIP, portanto, medida de decaimento do sinal, em vez de recuperação de fluorescência e são úteis para determinar a mobilidade de proteínas assim como a proteína vaivém entre compartimentos celulares. Vinculação transitória é uma propriedade comum da cromatina proteínas associadas. Embora a maior fração de cada proteína cromatina é obrigado a cromatina em um dado momento no estado estacionário, a ligação é transitória e proteínas mais cromatina têm uma alta rotatividade de cromatina, com um tempo de residência na ordem de segundos. Estas propriedades são cruciais para a geração de elevada plasticidade no genoma de expressão 1. Experimentos fotobranqueamento são, portanto, particularmente útil para determinar plasticidade cromatina usando GFP fusão versões da cromatina proteínas estruturais, especialmente em células ES, onde a troca dinâmica de proteínas da cromatina (incluindo heterocromatina proteína 1 (HP1), histona H1 linker e histonas core) é maior do que em células diferenciadas 2,3.

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Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Descrevemos os métodos fotobranqueamento inclusive Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) para monitorar a dinâmica de proteínas da cromatina no tronco embrionárias (ES) células. Proteínas da cromatina dinâmica, que é considerado um dos meios para estudar a plasticidade da cromatina, é reforçada em células pluripotentes.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...