Name: photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим членов Meshorer лаборатории, особенно Шай Melcer, Ади Alajem, Edupuganti Рагху Рам, Шри-Бади Sailaja, Анна Mattout и Альва Биран, за критические замечания и для устранения неисправностей фотообесцвечивания эксперименты на ежедневной основе. ЭМ Джозеф Х. и Belle Р. Браун старший преподаватель естественных наук и при поддержке Израиля научного фонда (ISF 943/09), министерства здравоохранения Израиля (6007) Европейский Союз (IRG-206872 и 238176), Израиль онкологический научный фонд, внутренних прикладной медицинской Гранты Еврейского университета и Израильского института психобиологического.

1. Покрытие ЭС клетки Т = 0 часов MEF покрытием <ol><li> Пальто жить изображений 8-и μ-Слайды (ibidi, Мюнхен, Германия) с желатином или в патрон покровные стекла (Lab-Tek, Рочестер, штат Нью-Йорк) или стеклянным дном блюда культуры (Маттек; Ashland, MA). Оставьте на 5-30 минут и аспирации от сво...

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

В отличие от большинства имеющихся методов, которые включают очищенный от хроматина клеточных популяций или фиксированные клетки, FRAP экспериментов следить за изменениями в динамике хроматина белков в живых клетках. Мы обнаружили, динамика хроматина белки быть хорошим индикатором дл?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Сигма </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Желатин </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Гибко </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Транзит-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-и μ-слайды </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) и флуоресценции Потеря В фотообесцвечивания (FLIP) позволяют изучения динамики белков в живых клетках с хорошим пространственным и временным разрешением. Здесь мы опишем, как выполнять FRAP и FLIP анализов хроматина белки, в том числе H1 и HP1, в мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. В FRAP эксперимента клетки трансфицированных, либо временно или стабильно, с белок сливается с зеленого флуоресцентного белка (GFP) или их производных (YFP, CFP, вишня и т.д.). В трансфекции, флуоресцирующие клетки, интенсивные сфокусированного лазерного луча отбеливатели относительно небольшой области интереса (ROI). Длины волны лазера выбирается в соответствии с флуоресцентный белок используется для синтеза. Лазерного света необратимо отбеливатели флуоресцентный сигнал молекул в рентабельности инвестиций и, сразу же после отбеливания, восстановления флуоресцентного сигнала в беленой площадь - опосредовано замены беленой молекул с небеленой молекул - это контролируется с помощью изображений промежуток времени. Созданный флуоресценции кривые восстановления предоставить информацию о подвижности белка. Если флуоресцентные молекулы неподвижны, не флуоресценции восстановление будет наблюдаться. В дополнительный подход, флуоресцентная Потери в фотообесцвечивания (FLIP), лазерный луч отбеливатели же месте неоднократно и интенсивность сигнала измеряется в других флуоресцирующих клеток. FLIP экспериментов поэтому мера сигнал распада, а не восстановление флуоресценции и полезны для определения белка мобильность, а также белка курсируя между сотовой отсеков. Переходные обязательным является общим свойством хроматина белков, связанных с. Хотя основной доли каждого белка хроматина связана с хроматина в любой момент времени в равновесном состоянии, обязательным является временным, и большинство хроматина белки имеют высокий оборот по хроматина, с временем пребывания в порядке секунд. Эти свойства имеют решающее значение для получения высокой пластичностью в экспрессии генома 1. Фотообесцвечивания эксперименты поэтому особенно полезен для определения хроматина пластичность использования GFP-фьюжн версии хроматина структурных белков, особенно в ЭС клетки, где динамический обмен белков хроматина (в том числе гетерохроматин белок 1 (HP1), компоновщик гистона H1 и основные гистонов) выше, чем в дифференцированных клетках 2,3.

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Мы опишем методы, включая фотообесцвечивания флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) и флуоресценции Потеря В фотообесцвечивания (FLIP) для контроля динамики хроматина белка в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Хроматин динамики белков, который считается одним из средств для изучения хроматина пластичность, усиливается в плюрипотентные клетки.

Фотообесцвечивания Анализы (FRAP и FLIP), чтобы измерить хроматина Динамика белков в живых эмбриональных стволовых клеток

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Распространение человеческих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Структурирование эмбриональных стволовых клеток Использование Био Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Замораживание и размораживание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Использование LysoTracker обнаружить запрограммированной смерти клеток в эмбрионы и дифференциации эмбриональных стволовых клеток

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Использование plusTipTracker Программное обеспечение для измерения микротрубочек Динамика в<em&gt; Xenopus Хепориз</em&gt; Шишки роста

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...