Name: methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health DK074656 e AI56374 (CEM), così come la Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. Preparazione di cellule <ol><li> Obiettivo coltura cellulare: Cultura delle linee di cellule beta del mouse, NIT-1 e NIT-4, era un 1,2 precedentemente descritta in DMEM supplementato con 10% FBS, 0,02% BSA, non aminoacidi essenziali, HEPES 15mm, 16,5 mm Glocose e penicillina / streptomicina. Per 51 etichettatura Cr, le cellule di semi in un piatto fondo da 96 pozzetti alla piastra di coltura 5X10 4 cellule / pozzetto in 200 microlitri terreno di coltura. Per gli esperimenti di micro...

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

Cellule T citotossiche mediate la morte delle cellule beta è la fisiopatologia principale di diabete di tipo 1 5. Saggi di CML con 51 rilascio Cr ci permettono di studiare il grado di effettrici bersaglio risposta 6. Tuttavia, il processo dettagliate e percorsi di T mediata dalle cellule morte delle cellule beta non è ancora pienamente compreso. Dal momento che i mitocondri sono fondamentali per la funzione delle cellule beta e la morte 7, ci siamo concentrati sui cambiament...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> CR-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrametil rodamina estere metilico (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotopo </td><td> mimotopes.com </td><td> aminoacido sequenza: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; S </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminoacidi non essenziali </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gemelli </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo senza DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HERAcell 150i </td><td> Mantenuto sterile per colture cellulari </td></tr><tr><td> Cappa di sicurezza biologica </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi cultura usa e getta, 6x50 millimetri di vetro Lime </td><td> Pescatore </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gamma contatore </td><td> Perkin Elmer </td><td> Wizard 1470 Gamma contatore automatico </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td> Confocale LSM 510 Meta </td><td> Con stadio motorizzato e la camera di cellule vive </td></tr><tr><td> Pipetta (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubi (Ambra) </td><td> Pescatore </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Sorvall Legenda RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Mice </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Mice </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / mice β F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Impianto di animali allevati in UF </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

Diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia mediata da cellule T autoimmuni. Durante la patogenesi, i pazienti diventano progressivamente più insulinopenic come la produzione di insulina è perso, probabilmente questa è dovuta alla distruzione delle cellule beta pancreatiche da parte delle cellule T. La comprensione dei meccanismi di morte delle cellule beta durante lo sviluppo del diabete di tipo 1 fornirà spunti per generare una cura efficace per questa malattia. Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC), saggi, storicamente, hanno utilizzato il radionuclide cromo 51 (51 Cr) per etichettare le cellule bersaglio. Questi obiettivi sono quindi esposti alle cellule effettrici e il rilascio di 51 Cr da cellule bersaglio viene letto come un&#39;indicazione di mediata dai linfociti morte cellulare. Inibitori di conseguenza la morte cellulare in versione ridotta di 51 Cr. Come cellule effettrici, abbiamo utilizzato un autoreattivi attivati ​​popolazione clonale di CD8 + linfociti T citotossici (CTL) isolato da un topo transgenico magazzino sia per l&#39;alfa e catene beta del recettore AI4 delle cellule T (TCR). AI4 cellule T attivate sono state co-coltura con 51 cellule bersaglio Cr etichettati NIT per 16 ore, il rilascio di 51 Cr è stato registrato per calcolare lisi specifiche Mitocondri partecipare a molti eventi fisiologici importanti, come la produzione di energia, regolazione della trasduzione del segnale, e l&#39;apoptosi. Lo studio delle cellule beta cambia mitocondriale funzionale durante lo sviluppo di diabete di tipo 1 è una zona nuova della ricerca. Utilizzando il potenziale di membrana mitocondriale colorante tetrametile rodamina estere metilico (TMRM) e confocale di immagini microscopiche cellule vive, abbiamo monitorato il potenziale della membrana mitocondriale nel corso del tempo nella linea di cellule beta NIT-1. Per gli studi di imaging, le cellule T effettrici AI4 sono stati etichettati con il colorante fluorescente nucleare colorazione PicoGreen. NIT-1 le cellule e le cellule T sono state co-coltura in chambered coprioggetti e montato sul palco microscopio dotato di una camera di cellule vive, controllata a 37 ° C, con il 5% di CO 2, e umidificata. Durante questi esperimenti immagini sono state prese di ogni cluster ogni 3 minuti per 400 minuti. Più di un corso di 400 minuti, abbiamo osservato la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale in NIT-1 gruppi di cellule in cui sono state allegate AI4 cellule T. Nell&#39;esperimento controllo simultaneo in cui NIT-1 cellule sono state co-coltura con MHC mis-matched cellule umane Jurkat linfociti, potenziale di membrana mitocondriale è rimasto intatto. Questa tecnica può essere usata per osservare in tempo reale i cambiamenti del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule sotto l&#39;attacco dei linfociti citotossici, citochine o altri reagenti citotossici.

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
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