Name: a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

בני הזוג. CJP Grimmelikhuijzen ומיכאל וויליאמסון מאוניברסיטת קופנהאגן (דנמרק) זוכים להערכה למתן aequorin הפלסמיד. משתף פעולה שלנו, ד&quot;ר רונלד J. נחמן ARS-USDA (טקסס, ארה&quot;ב), הוא הודה לסינתזה פפטיד ו למתן את הקורא צלחת NOVOstar.

<ol>
	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הצלחנו לבצע את אפיון פונקציונלי של הקולטן neuropeptide הראשון שהתגלה מן Arachnida (קרציות, קרדיות, עכבישים), הקולטן kinin סמן, תוך שימוש בפרוטוקול זה. שיטה זו כוללת שלושה יישומים ראשוניים. ראשית, הטכניקה ניתן ליישם על deorphanization הקולטן באמצעות מדידות פעילות ליגנד. שנית, assay יכול לפתור ליגנד לקולטן מבנה פעילות יחסים (SAR). שלישית, השיטות ניתן להשתמש גילוי תרופות. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את פעילותו של אגוניסטים או אנטגוניסטים על כמעט כל GPCR. אנחנו מתחילים להתאים את פרוטוקול להקרנה של ספריות קטנות. השורה תא השתמשנו אינו מבטא את החלבון נמצא בכל מקום G G 16. לא היינו צריכים את זה כי arthropod קולטנים kinin האות דרך החלבון GQ ואת מפל סידן תוך תאי והם לשמר את המאפיינים איתות בתאי יונקים כפי שמוצג כאן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO-K1 תאים </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, ארה&quot;ב </td></tr><tr><td> F12K בינוני </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> לאנטיביוטיקה Antimycotic </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-ממ אני מופחת בינוני סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep ספין miniprep ערכת </td><td> Qiagen בע&quot;מ </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 transfection מגיב </td><td> רוש </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-היטב microtitere לבן דק לתחתית צלחת </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> סידן ללא DMEM התקשורת </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> מוארת-Line Hemacytometer </td><td> האוסר מדעי </td><td></td><td> Horsham, הרשות הפלסטינית </td></tr><tr><td> NOVOstar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פריזמה תוכנה 4.0 </td><td> GraphPad תוכנה בע&quot;מ </td><td></td><td> סן דייגו, קליפורניה, ארה&quot;ב </td></tr><tr><td> T-25 ו-T-75 צלוחיות </td><td> BD פלקון </td><td> 353014 ו - 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

קולטנים arthropod הורמון הם יעדים פוטנציאליים הדברה הרומן כפי שהם מווסתים תהליכים פיזיולוגיים רבים והתנהגותיים חיוני. רובם שייכים superfamily של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs). התמקדנו באפיון קולטנים kinin arthropod מן סמן את יתושים. Kinins arthropod הם נוירופפטידים רב תכליתיים עם myotropic, משתן, תפקוד עצבי. הנה שיטה מנתח שיטתי של מבנה הפעילות של מערכות יחסים kinins חרקים על שני Heterologous kinin קולטן להביע מערכות מתואר. אנו מספקים מידע חשוב רלוונטיים לפיתוח של אנלוגים kinin biostable עם פוטנציאל לשבש את משתן, myotropic, ו / או תהליכי העיכול קרציות ויתושים. הקולטנים kinin מן סמן את הבקר בדרום, Boophilus microplus (קאנסטריני), ואת Aedes יתוש aegypti (לינאוס), באו לידי ביטוי ביציבות בקו תא יונקים CHO-K1. מנתח פונקציונלית של קולטנים אלה הושלמו באמצעות פליטת אור סידן צלחת assay אשר מודד פליטת אור תאיים כדי לקבוע רמות הסידן cytoplasmic על פי בקשה פפטיד תאים אלה רקומביננטי. שיטה זו מנצלת את החלבון aequorin, photoprotein מבודד זורח מדוזה. אנו transiently transfected aequorin פלסמיד (mtAEQ/pcDNA1) בקווים תא ביציבות הביע את הקולטנים kinin. תאים אלה טופלו אז עם coelenterazine cofactor, אשר קומפלקסים עם aequorin תאיים. קשר זה שובר בנוכחות סידן, פולטות רמות הארה מעיד על ריכוז סידן. כאשר הקולטן kinin אותות באמצעות שחרור סידן תוך תאי, עוצמת האות קשורה עוצמה של הפפטיד. פרוטוקול זה הוא סינתזה של פרוטוקולים שתואר קודם לכן עם מספר שינויים: הוא מציג צעד אחר צעד הוראות לביטוי יציב של GPCRs בקו תא יונקים באמצעות מבחני צלחת תפקודית (Staubly et al, 2002 ו אורוות et al, 1997.. ). שימוש במתודולוגיה זו, הצלחנו להקים שורות תאים יציבות המבטאת את היתושים ואת kinin קולטנים סמן, להשוות את העוצמה של שלושה kinins יתושים, לזהות קריטי עמדות החומצה האמינית לאינטראקציה ליגנד לקולטן, ולבצע למחצה ההקרנה של פפטיד הספרייה. מכיוון kinins חרקים רגישים השפלה אנזימטית מהירה על ידי peptidases אנדוגני, הם מוגבלים קשות ככלים הדברה או מחקרים endocrinological בשימוש. לכן בדקנו גם אנלוגים kinin isobutyric המכילים חומצה אמינית (AIB) כדי לשפר את העוצמה שלהם biostability. זה אנלוגי peptidase עמידים מייצג להוביל חשוב בהתפתחות של biostable אנלוגים kinin חרקים עשויה לסייע בפיתוח של neuropeptide מבוססי אסטרטגיות שליטה arthropod.

Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

פרוטוקול זה מספק הוראות לבחירת המשובטים תאים קו פליטת אור סידן assay כדי לנתח את מבנה פעילות יחסי נוירופפטידים arthropod מסונתז על GPCRs מאותו מקור שלהם. Assay זה יכול לשמש עבור deorphanization קולטן מבנה פעילות מחקרים היחסים לעיצוב אנלוגי פפטיד סינתטי / סמים להוביל לגילוי.

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing<em&gt; Scapularis קרצית,</em&gt; את הטיק השחור רגליים: האכלת שלבי Immature על עכברים

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

חרוז מבוסס Assay מולטיפלקס לניתוח של פרופילים ציטוקין דמעה

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

זיהוי נוגדן Anti-aquaporin-4 G בנסיוב אדם על ידי Assay מבוססת-תא

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...