Name: high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00
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C. elegans Transgene wurden von den Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN) zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 gewähren NS0667678-01 bis KS unterstützt. Alle Autoren nahmen an der Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten. CKL, KS, und KPC nahmen schriftlich und Überarbeitung des Manuskripts.

1. Vorbereitung der bakteriellen Wurm Lebensmittel Tag 1 <ol><li> 5 ml gesättigte E. coli OP50 Bakterienkultur zu 500 ml Brühe Terrific mit 50 ug / ml Streptomycin ergänzt und wachsen in einem Schüttelinkubator (225 rpm) über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> Tag 2 <ol start="2"><li> Split der Nacht Bakterienkultur in zehn 50 ml-und Zentrifugenröhrchen Bakterien in einer Kühlzentrifuge bei 2.500 rcf für 20 Minuten. </li><li> Abdekantieren LB Brühe und re...

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	<li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade.">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+versatile+platform+for+drug+discovery.">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li><li>An, J. 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Wir stellen eine Methode zur Kultivierung und Abgabe einer großen Anzahl von transgenen Nematoden. Die Ausrüstung für die Kultivierung von Würmern verwendet wird Standard für Labors, die molekulare Klonierung und der Liquid-Handling-und Fluoreszenz-Ausstattung ist Standard für Labors Verarbeitung einer großen Anzahl von Mikroplatten. Andere Methoden der Abgabe eine große Anzahl von Live-C elegans teure Partikel Sortieranlagen 19. Die Pgst-4:: GFP-Assay kann zum Screening niedermoleku...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> LB-Medium </td><td> Research Products International Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific Bouillon </td><td> Research Products International Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-Mode Mikroplatten-Reader </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filter: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Select Dispenser </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm Verzicht Kolben </td><td> Süd Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Benutzerdefinierte montiert (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 Mikrotiterplatten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Atmungsaktive Dichtband </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-Hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglon ist in DMSO gelösten </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgenen Stammes </td><td> Autor Labor </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP und PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains

High-Throughput-Screening (HTS) ist ein leistungsstarkes Konzept zur Identifizierung von chemischen Modulatoren der biologischen Prozessen. Allerdings sind viele Verbindungen in Bildschirmen mit Zellkultur-Modellen identifiziert oft, dass sie giftig oder pharmakologisch inaktiv in vivo 1-2. Screening in ganz Tiermodelle können zur Vermeidung dieser Gefahren und optimieren den Weg zur Entwicklung von Medikamenten. C. elegans ist ein vielzelligen Organismus-Modell auch für HTS geeignet. Es ist klein (&lt;1 mm) und kann wirtschaftlich gezüchtet werden und abgefüllt in Flüssigkeiten. C. elegans ist auch einer der experimentell handhabbar Tiermodelle erlauben eine schnelle und detaillierte Identifizierung von Wirkstoffkandidaten mode-of-Aktion 3. Wir beschreiben ein Protokoll für die Kultivierung und Abgabe fluoreszierender Stämme von C. elegans für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken oder den Nachweis von Umweltschadstoffen, dass die Expression eines bestimmten Gens zu verändern. Eine große Anzahl von entwicklungspolitisch synchronisiert Würmer sind in flüssiger Kultur angebaut, geerntet, gewaschen und aufgehängt an einer definierten Dichte. Würmer sind dann schwarz, mit flachem Boden 384-well-Platten mit einer peristaltischen Flüssigkeitsspender aufgenommen. Kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Proben (z. B. Wasser, Nahrung oder Boden) kann in die Vertiefungen mit Würmern hinzugefügt werden. In vivo Echtzeit-Fluoreszenz-Intensität mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader gemessen. Diese Methode kann zu jeder induzierbaren Gens in C. angepasst werden elegans, für die eine geeignete Reporter zur Verfügung steht. Viele induzierbare Stress-und Entwicklungsbiologie transkriptionelle Wege sind gut in C definiert elegans und GFP transgenen Reporter-Stämme bereits für viele von ihnen 4 existieren. Wenn mit der entsprechenden transgenen Reporter kombiniert, können unsere Methode verwendet, um für die Bahn-Modulatoren Bildschirm oder robust Biosensor-Assays für Umweltschadstoffe zu entwickeln. Wir zeigen unseren C. elegans Kultur und Abgabe-Protokoll mit einem HTS-Assay wir entwickelt, um die C-Monitor elegans cap &#39;n&#39; Kragen Transkriptionsfaktor SKN-1. SKN-1 und seine Säuger Homolog Nrf2 aktivieren zytoprotektive Gene während der oxidative Stress und xenobiotische 5-10. Nrf2 schützt Säugetiere aus zahlreichen altersbedingten Erkrankungen wie Krebs, Neurodegeneration und chronischen Entzündungen und ist zu einem wichtigen chemotherapeutischen Ziel 11-13. Unser Test auf einem GFP transgenen Reporter für die SKN-1 Zielgen gst -4 14 basiert, die kodiert für ein Glutathion-S-Transferase 6. Die gst -4 Reporter ist auch ein Biosensor für Fremdstoff-und oxidative Chemikalien, die SKN-1 zu aktivieren und können verwendet werden, um niedrige Konzentrationen von Kontaminanten wie Acrylamid und Methyl-Quecksilber 15-16 zu erkennen.

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe von<em&gt; C. elegans</em&gt; Stämme, fluoreszierenden Reporter-Proteinen wird beschrieben, dass keine teuren Sortieranlagen. Dieser Ansatz kann auf zahlreiche induzierbaren angewendet werden<em&gt; C. elegans</em&gt; Gene für die Wirkstoffforschung oder Biosensorik von Schadstoffen.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Forschung

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

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RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

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Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

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Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

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Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

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We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

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We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...