Name: high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00
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C. elegans transgeni sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 concedere NS0667678-01 a KS. Tutti gli autori hanno partecipato alla raccolta, analisi e interpretazione dei dati. CKL, KS, e KPC ha partecipato alla stesura e alla revisione del manoscritto.

1. Preparazione dei cibi verme batterica Giorno 1 <ol><li> Aggiungere 5 ml di saturi E. coli OP50 coltura batterica di 500 ml di brodo Terrific integrata con 50 mg / ml di streptomicina e crescere in un incubatore agitazione (225 rpm) durante la notte a 37 ° C. </li></ol> 2 ° giorno <ol start="2"><li> Suddividere la cultura batterica durante la notte in dieci provette da 50 ml e batteri centrifuga in una centrifuga refrigerata a 2.500 rcf per 20 minuti. </l...

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	<li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade.">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+versatile+platform+for+drug+discovery.">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li><li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity.">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li><li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide,+a+harmful+substance+in+food.">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li><li>Chase, D. 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Vi presentiamo un metodo per la coltura e l&#39;erogazione un gran numero di nematodi transgenici. Le attrezzature utilizzate per la coltura worm è standard per i laboratori che effettuano la clonazione molecolare e la gestione dei liquidi e delle attrezzature fluorescenza è standard per i laboratori di lavorazione un gran numero di micropiastre. Altri metodi di dispensare un gran numero di vivere C. elegans richiedono costosi impianti di smistamento delle particelle 19. Il Pgst-4:: GFP te...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> LB brodo </td><td> Ricerca Products International Corp. </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific brodo </td><td> Ricerca Products International Corp. </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy HT ™ Multi-mode micropiastre Reader </td><td> Biotek </td><td></td><td> Filtri: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Seleziona Dispenser </td><td> Biotek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm fiasco di erogazione </td><td> Southern Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Assemblati su misura (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 micropiastre </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Nastro di tenuta traspirante </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-idrossi-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone è dissolto in DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans ceppo transgenico </td><td> Autore di laboratorio </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP e PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains

High-throughput screening (HTS) è un approccio potente per identificare modulatori chimici dei processi biologici. Tuttavia, molti composti identificati nel schermi utilizzando modelli di coltura cellulare si trovano spesso ad essere tossici o farmacologicamente attive in vivo 1-2. Lo screening in modelli animali tutto può aiutare ad evitare queste trappole e semplificare il percorso per lo sviluppo di farmaci. C. elegans è un organismo pluricellulare modello adatto per HTS. Si tratta di piccole dimensioni (&lt;1 mm) e può essere economicamente colto e dispensati in liquidi. C. elegans è anche uno dei modelli animali più docili sperimentalmente che consentono la determinazione rapida e dettagliata dei farmaci modalità d&#39;azione 3. Abbiamo descritto un protocollo per la coltura e l&#39;erogazione ceppi fluorescenti di C. elegans per high-throughput screening di librerie chimiche o rilevamento di contaminanti ambientali che alterano l&#39;espressione di un gene specifico. Un gran numero di vermi evolutivamente sincronizzati sono cresciuti in coltura liquida, raccolte, lavate, e sospeso ad una densità definita. I worm sono poi aggiunti al nero, dal fondo piatto a 384 pozzetti utilizzando un dosatore peristaltico liquido. Piccole molecole da una biblioteca chimica o campioni (per esempio, acqua, cibo, o suolo) possono essere aggiunti ai pozzetti con i vermi. In vivo, in tempo reale intensità di fluorescenza viene misurata con un lettore di fluorescenza per micropiastre. Questo metodo può essere adattato a qualsiasi gene inducibile in C. elegans per i quali un giornalista idonei. Lo stress inducibile molti e di sviluppo percorsi trascrizionale sono ben definiti in C. elegans GFP e reporter di ceppi transgenici esistono già per molti di loro 4. Quando combinato con i giornalisti appropriato transgenico, il nostro metodo può essere usato per individuare modulatori percorso o per sviluppare robuste analisi biosensore per i contaminanti ambientali. Dimostriamo il nostro C. elegans, la cultura e la dispensazione di protocollo con un dosaggio HTS abbiamo sviluppato per monitorare la C. trascrizione elegans cap &#39;n&#39; fattore collare SKN-1. SKN-1 e il suo omologo di mammifero Nrf2 attivare i geni citoprotettivo durante lo stress ossidativo e xenobiotici 5-10. Nrf2 mammiferi protegge da numerose malattie legate all&#39;età come il cancro, neurodegenerazione, e l&#39;infiammazione cronica ed è diventato uno dei principali bersagli chemioterapici 11-13. La nostra analisi si basa su un reporter GFP transgenico per il SKN-1 gene bersaglio -4 gst 14, che codifica per una glutatione s-transferasi 6. Il reporter gst -4 è anche un biosensore per le sostanze chimiche xenobiotiche e ossidativo che attivano SKN-1 e può essere utilizzato per rilevare i bassi livelli di contaminanti quali acrilamide e il metilmercurio 15-16.

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Una procedura per liquidi a base di coltura e distribuzione dei<em&gt; C. elegans</em&gt; Giornalista ceppi che esprimono proteine ​​fluorescenti è descritto che non richiede costose attrezzature di smistamento. Questo approccio può essere applicato a numerosi inducibile<em&gt; C. elegans</em&gt; Geni per la scoperta di nuovi farmaci o sensori biologici di contaminanti.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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