Name: high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00
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C. elegans transgenes foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos os autores participaram da coleta, análise e interpretação dos dados. CKL, KS, e KPC participaram da elaboração e revisão do manuscrito.

1. Preparação de comida de verme bacteriana 1 dia <ol><li> Adicionar 5 ml de E. saturada coli ml caldo de cultura bacteriana OP50 a 500 Terrific suplementado com estreptomicina 50 mg / ml e crescer em uma incubadora de agitação (225 rpm) durante a noite a 37 ° C. </li></ol> Dia 2 <ol start="2"><li> Dividir a cultura de bactérias durante a noite em dez tubos de 50 ml e bactérias centrífuga em uma centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 m...

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	<li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade.">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+versatile+platform+for+drug+discovery.">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li><li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4/DDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans.">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li><li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li><li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans.">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li><li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1/Nrf.">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , (2009).</li><li>Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li><li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway.">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li><li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention.">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li><li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+signaling,+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice.">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li><li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li><li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity.">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li><li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide,+a+harmful+substance+in+food.">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li><li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans, a Practical Guide. , (2005).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li></ol>

Nós apresentamos um método para cultivo e distribuição de um grande número de nematóides transgênicos. O equipamento utilizado para vermes é padrão para laboratórios de clonagem molecular e da manipulação de líquidos e equipamentos de fluorescência é padrão para os laboratórios de processamento de um grande número de microplacas. Outros métodos de dispensar um grande número de viver C. elegans exigem partículas caros equipamentos de triagem 19. O Pgst-4:: ensaio de G...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> LB </td><td> Research Products International Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific caldo </td><td> Research Products International Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-Modo de Leitora </td><td> Biotek </td><td></td><td> Filtros: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Dispenser Selecione </td><td> Biotek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm frasco de dispensação </td><td> Southern Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Personalizado montada (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplacas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Fita de vedação respirável </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hidroxi-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone é dissolvido em DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgênicos tensão </td><td> Laboratório autor </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP e PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains

High-throughput screening (HTS) é uma poderosa abordagem para a identificação de moduladores de química de processos biológicos. No entanto, muitos compostos identificados em telas usando modelos de cultura celular são encontrados frequentemente para ser tóxicos ou farmacologicamente inativas in vivo 1-2. Triagem em modelos animais inteiros pode ajudar a evitar estas armadilhas e agilizar o caminho para o desenvolvimento de drogas. C. elegans é um organismo multicelular modelo adequado para HTS. Ele é pequeno (&lt;1 mm) e pode ser economicamente cultivadas e distribuídas em líquidos. C. elegans é também um dos modelos animais mais experimentalmente tractable permitindo identificação rápida e detalhada de drogas modo-de-acção 3. Nós descrevemos um protocolo para cultivo e distribuição de linhagens fluorescentes de C. elegans para high-throughput screening de bibliotecas de química ou de detecção de contaminantes ambientais que alteram a expressão de um gene específico. Um grande número de worms developmentally sincronizado são cultivadas em cultura líquida, colhidas, lavadas e suspensas em uma densidade definida. Worms são então adicionados ao preto, de fundo chato de 384 poços placas utilizando um dispensador peristáltica líquido. Pequenas moléculas de uma biblioteca de produtos químicos ou amostras de teste (por exemplo, água, alimentos, solo ou) podem ser adicionados a poços com worms. In vivo, em tempo real intensidade de fluorescência é medida com um leitor de microplacas de fluorescência. Este método pode ser adaptado a qualquer gene induzível em C. elegans para o qual um repórter está disponível. Estresse induzível muitos caminhos e de desenvolvimento de transcrição são bem definidas em C. elegans e tensões repórter GFP transgênicos já existem em muitos deles 4. Quando combinado com os repórteres apropriado transgênicos, o nosso método pode ser utilizado para triagem de moduladores caminho ou para desenvolver robusto ensaios biosensor para os contaminantes ambientais. Demonstramos nossa C. elegans cultura e dispensando protocolo com um ensaio HTS que desenvolvemos para monitorar o C. fator &#39;n&#39; elegans cap transcrição colar SKN-1. SKN-1 e seu homólogo Nrf2 mamíferos ativar genes citoprotetora durante o estresse oxidativo e xenobióticos 50-10. Nrf2 protege mamíferos de várias doenças relacionadas à idade, tais como câncer, neurodegeneração, e inflamação crônica e se tornou um dos principais alvos quimioterápicos 11-13. Nosso ensaio é baseado em um repórter GFP transgênicos para o SKN-1 gene-alvo gst -4 14, que codifica a 6 glutationa-s-transferase. O repórter gst -4 é também um biosensor para produtos químicos xenobióticos e oxidativa que ativam SKN-1 e pode ser usado para detectar baixos níveis de contaminantes, como acrilamida e metil-mercúrio 15-16.

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Um procedimento para líquidos baseados em cultura e distribuição de<em&gt; C. elegans</em&gt; Cepas que expressam proteínas fluorescentes repórter é descrito que não requer equipamento caro classificação. Esta abordagem pode ser aplicada a inúmeras induzível<em&gt; C. elegans</em&gt; Genes para a descoberta de drogas ou biosensoriamento de contaminantes.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Biologia

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

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