Name: high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00
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C. elegans transgénicos fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos los autores participaron en la recolección, análisis e interpretación de datos. CKL, KS, y KPC participaron en la redacción y revisión del manuscrito.

1. Preparación de comida de gusanos bacteriana Día 1 <ol><li> Añadir 5 ml de grasa saturada E. coli OP50 cultivo bacteriano a 500 ml de caldo fabuloso suplementado con 50 mg / ml de estreptomicina y crecer en una incubadora de agitación (225 rpm) durante la noche a 37 ° C. </li></ol> Día 2 <ol start="2"><li> Dividir el cultivo de bacterias durante la noche en diez tubos de 50 ml y bacterias centrífuga en una centrífuga refrigerada a 2.500 rcf durante ...

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	<li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade.">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+versatile+platform+for+drug+discovery.">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li><li>An, J. 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Se presenta un método para cultivar y distribuir grandes cantidades de nematodos transgénicos. El equipo utilizado para el cultivo de lombrices es el estándar para los laboratorios que realizan la clonación molecular y el manejo de líquidos y el equipo de fluorescencia es el estándar para los laboratorios de procesamiento de un gran número de microplacas. Otros métodos de dispensación de un gran número de vivir C. elegans requieren partículas caro equipo de clasificación 19. El Pgst-4...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> LB caldo </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Excelente caldo de </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-modo de lector de microplacas </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filtros: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Seleccione dispensador </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gusano de dispensación frasco </td><td> El sur de Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Costumbre montado (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplacas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta de sellado transpirable </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hidroxi-p-naphthoqinone) juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone se disuelve en DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgénicos cepa </td><td> Autor de laboratorio </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP y PDOP 3:: SDP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains

Selección de alto rendimiento (HTS) es un poderoso método para la identificación de moduladores químicos de los procesos biológicos. Sin embargo, muchos de los compuestos identificados en las pantallas usando modelos de cultivo celular se encuentran a menudo que son tóxicos o inactivos farmacológicamente in vivo 1-2. Proyección en modelos animales todo puede ayudar a evitar estos escollos y agilizar el camino hacia el desarrollo de fármacos. C. elegans es un organismo multicelular modelo muy adecuado para HTS. Es pequeño (&lt;1 mm) y puede ser económicamente culta y se distribuye en los líquidos. C. elegans es también uno de los modelos animales más manejables experimentalmente que permitan la identificación rápida y detallada de las drogas el modo de acción 3. Se describe un protocolo para el cultivo y distribución de las cepas fluorescentes C. elegans para la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas o detección de contaminantes ambientales que alteran la expresión de un gen específico. Un gran número de gusanos de desarrollo sincronizado en un cultivo líquido, cosecha, lavado, y suspendió a una densidad definida. Los gusanos se añaden al negro, de fondo plano placas de 384 pocillos con un dispensador de líquidos peristáltica. Las moléculas pequeñas de una biblioteca de química o de las muestras de ensayo (por ejemplo, agua, alimentos o suelo) se pueden añadir a los pozos con los gusanos. En vivo y en tiempo real la intensidad de fluorescencia se mide con un lector de microplacas de fluorescencia. Este método se puede adaptar a cualquier gen inducible en C. elegans para que un periodista adecuados. Estrés inducible muchas vías de desarrollo y de la transcripción están bien definidos en C. elegans y las buenas prácticas agrarias reportero cepas transgénicas ya existen en muchos de ellos 4. Cuando se combina con los reporteros transgénicos corresponda, nuestro método puede ser utilizado para la detección de moduladores de la vía o el desarrollo de sólidas pruebas de biosensor de contaminantes ambientales. Demostramos nuestro C. elegans la cultura y el protocolo de dispensación con un ensayo HTS que hemos desarrollado para controlar el C. factor de transcripción collar &#39;n&#39; elegans tapa SKN-1. SKN-1 y su homólogo de mamíferos Nrf2 activar genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y 10.5 xenobióticos. Nrf2 protege a los mamíferos a partir de numerosos trastornos relacionados con la edad como el cáncer, neurodegeneración y la inflamación crónica y se ha convertido en un importante objetivo de la quimioterapia 11-13. Nuestro análisis se basa en un reportero GFP transgénicos para la SKN-1 del gen objetivo -4 gst 14, que codifica un 6 glutatión-s-transferasa. El periodista gst -4 es también un biosensor para los productos químicos xenobióticos y de oxidación, que activan SKN-1 y se puede utilizar para detectar bajos niveles de contaminantes tales como la acrilamida y el metil-mercurio 15-16.

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Un procedimiento de cultivo a base de líquido y dispensación de<em&gt; C. elegans</em&gt; Cepas que expresan proteínas fluorescentes reportero se describe que no requiere de equipos de selección caro. Este enfoque puede aplicarse a numerosas inducible<em&gt; C. elegans</em&gt; Genes para la detección de drogas o biosensores de contaminantes.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Investigación

Biología

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

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C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

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High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

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C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

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Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

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