Name: isolation of brain-infiltrating leukocytes
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00
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Este trabalho foi financiado por bolsa NS64571 do NINDS (CLH), por um prêmio no início de desenvolvimento de carreira da Clínica Mayo (CLH), e por um generoso dom de Donald e Herdrich Frances (CLH). Gostaríamos de agradecer a Clínica Mayo Núcleo Citometria de Fluxo para obter assistência.

1. Injeção intracraniana de vírus: A técnica a seguir foi modificada e utilizada extensivamente por nosso laboratório e colegas. Resumidamente, a injeção intracraniana da estirpe de Daniel de murino Theiler de encefalomielite vírus (TMEV) ou sham-infecção (1, 10) é realizada em ratos jovens (de preferência 5-6 semanas de idade) para obter leucócitos cérebro infiltrando (Bils). Por favor, note que os resultados diferem entre estirpe de Daniel, a cepa feijão e da estirpe GDVII. Pa...

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	<li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornaviruses+and+cell+death.">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li><li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay.">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li><li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li><li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain.">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li><li>Donovan, J., &amp;amp, P. . B. r. o. w. n., , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+&#38;+restraint.">Handling &#38; restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenteral+injections.">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li><li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur.">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li><li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination.">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li><li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+in+mice:+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination.">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li></ol>

Rotineiramente uso de citometria de fluxo para determinar a qualidade da preparação das células cerebrais se infiltrando, e para distinguir diferentes populações de células do sistema imunológico 2, 9. Aguda em tempo de pontos, o nosso método Bils rendimentos elevados percentuais de monócitos inflamatória dentro da população CD45hi, bem como altas porcentagens de macrófagos na população CD45lo. Isto indica que uma resposta imune reprodutíveis dentro do cérebro pode ser robustamente caracteriz...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Howe Lab </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Estirpe de Daniel </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> de fundo redondo de Oak tubos de centrífuga de Ridge </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cônicos </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 mL de vidro Pyrex marca moedor de tecido Tenbroeck </td><td> Pescador </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 coador célula M </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS tubos </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> soro fetal bovino </td><td> Sigma </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 hibridoma </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar placa V-bottom </td><td> Corning </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra centrífuga X-22R ou equivalente </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços balde placa e rotor </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor de ângulo fixo </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Programa FlowJo 7,5 </td><td> Árvore Star, Inc. </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> clone: ​​30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> clone: ​​RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> clone: ​​M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> clone: ​​BM8 </td></tr></tbody></table>

isolation of brain-infiltrating leukocytes

Nós descrevemos um método para preparar leucócitos cérebro infiltrando (Bils) de camundongos. Demonstramos como para infectar ratos com encefalomielite murina de Theiler vírus (TMEV) através de uma técnica de injeção intracraniana e rápida como purificar uma população de leucócitos enriquecido de células infiltrando a partir do cérebro inteiro. Resumidamente, os ratos são anestesiados com isoflurano em uma câmara fechada e são free-hand injetado com uma seringa de Hamilton para o córtex frontal. Ratos são, então, matou em vários momentos após a infecção por overdose isoflurano e cérebros inteiros são extraídos e homogeneizados em RPMI com um moedor de tecido Tenbroeck. Homogeneizados de cérebro são centrifugação em um gradiente de Percoll contínua de 30% para remover os restos celulares de mielina e outros. A suspensão de células é então forçada a 40 mM, lavado e centrifugado em um descontínua gradiente de Ficoll-Paque Plus para selecionar e purificar os leucócitos. Os leucócitos são então lavadas e ressuspendidas em tampão apropriado para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Citometria de fluxo revela uma população de células do sistema imunológico inato nas fases iniciais da infecção de camundongos C57BL / 6. Menos 24 horas após a infecção, subconjuntos múltiplas de células do sistema imunológico estão presentes no Bils, com uma população enriquecida de Gr1 +, CD11b + e + F4/80 células. Portanto, esse método é útil na caracterização da resposta imune à infecção aguda no cérebro.

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...