Name: isolation of brain-infiltrating leukocytes
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag NS64571 från NINDS (CLH), genom en tidig karriär utmärkelse från Mayo Clinic (CLH), och genom en generös gåva från Donald och Frances Herdrich (CLH). Vi vill tacka de Mayo Clinic Kärna flödescytometrisystem för hjälp.

1. Intrakraniell virus injektion: Följande Tekniken har ändrats och används i stor utsträckning av våra labb och kollegor. Kortfattat (1, 10) intrakraniell injektion av Daniels stam av Theiler är murina encefalomyelit virus (TMEV) eller simulerade-infektion utförs på unga möss (helst 5-6 veckors ålder) för att väcka hjärnan infiltrera leukocyter (BILS). Observera att resultaten kommer att variera mellan Daniels stam och BEAN stam, och GDVII stammen. För skörd BILS, möss får 2x...

<ol>
	<li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornaviruses+and+cell+death.">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li><li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay.">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li><li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li><li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain.">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li><li>Donovan, J., &amp;amp, P. . B. r. o. w. n., , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+&#38;+restraint.">Handling &#38; restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenteral+injections.">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li><li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur.">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li><li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination.">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li><li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+in+mice:+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination.">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li></ol>

Vi använder rutinmässigt flödescytometri för att avgöra både kvaliteten av hjärnan infiltrera cellberedningen och för att skilja olika populationer av immunceller 2, 9. Vid akuta gånger, ger våra BILS metod hög andel av inflammatoriska monocyter inom CD45hi befolkningen samt hög andel av makrofager i CD45lo befolkningen. Detta tyder på att ett reproducerbart immunsvar i hjärnan kraftigt kan präglas av vår metod. Denna teknik är av särskild betydelse för experime...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Howe Lab </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Daniels stam </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isofluran </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> rundbottnad Oak Ridge centrifugrör </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan Blå 0,4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml koniska rör </td><td> BD Falcon </td><td> 352.097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 ml glasflaska Pyrex varumärke Tenbroeck vävnad kvarn </td><td> Fisher </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 ìm cell sil </td><td> BD Falcon </td><td> 352.340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konisk </td><td> BD Falcon </td><td> 352.070 </td><td></td></tr><tr><td> bovint serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS rör </td><td> BD Falcon </td><td> 352.054 </td><td></td></tr><tr><td> fetalt bovinserum </td><td> Sigma </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 hybridom </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V-botten platta </td><td> Corning </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra X-22R centrifug eller motsvarande </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96-brunnars platta skopa och rotor </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Fast vinkel rotor </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7,5 </td><td> Träd Star, Inc. </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557.235 </td><td> klon: 30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553.128 </td><td> klon: RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> klon: M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> klon: BM8 </td></tr></tbody></table>

isolation of brain-infiltrating leukocytes

Vi beskriver en metod för att förbereda hjärnan infiltrera leukocyter (BILS) från möss. Vi visar hur du infektera möss med Theiler är murina encefalomyelit virus (TMEV) via en snabb intrakraniell injektionsteknik och hur man renar en leukocyt-berikad population av infiltrera celler från hela hjärnan. Kortfattat, möss är sövda med isofluran i en sluten kammare och är fri hand injiceras med en Hamilton sprutan i frontala cortex. Möss är sedan dödas vid olika tidpunkter efter infektion med isofluran överdos och hela hjärnor extraheras och homogeniseras i RPMI med en Tenbroeck vävnad kvarn. Brain homogenat centrifugeras genom en kontinuerlig 30% Percoll lutning för att ta bort myelinet och andra cell skräp. Cellsuspensionen sedan ansträngd vid 40 ìm, tvättas och centrifugeras för en diskontinuerlig Ficoll-Paque Plus lutning för att välja och rena leukocyter. Den leukocyter sedan tvättas och suspenderade i lämpliga buffertar för immunfenotypning med flödescytometri. Flödescytometri avslöjar en population av medfödda immunförsvaret celler i ett tidigt skede av infektionen i C57BL / 6 möss. 24 timmar efter infektion, flera delmängder av immunceller finns i BILS, med en berikad population av Gr1 +, CD11b + och F4/80 + celler. Därför är denna metod användbar i karakterisera immunsvaret mot akut infektion i hjärnan.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes at JoVE.com

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

En snabb metod för att få infiltrera leukocyter från mus hjärnan beskrivs. Denna metod använder en kontinuerlig Percoll lutning och diskontinuerliga Ficoll lutning för att välja och rena leukocyt-berikade lager. Isolerade leukocyter kan då präglas av flödescytometrisk mätningar.

Isolering av Brain-infiltrera leukocyter

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Dendritiska Mouse lungceller

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolering och analys av Brain-binds Leukocyter från<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infekterade möss

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik och Oxidativ Burst: Protokoll för isolering och utvärdering av humana leukocyter och trombocyter

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektiv Skörd av Marginating-lung leukocyter

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Selektiv Skörd av Marginating-lever leukocyter

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...