Name: isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans at JoVE.com

وأيد هذا العمل ماليا ANR (وكالة الأنباء الوطنية دي لا بحوث) ، فؤاد (رابطة مناهضة الفرنسية ليه الاعتلالات العضلية) ، وفيدر في PACA IRME (معهد بحوث سور دي لا Moelle épinière آخرون L&#39; دماغ). نشكر بامتنان ماري بيير بلانشار (جان روش معهد) ليساعدها على كفاءة أثناء تسجيل مرور الوقت.

1. مجموعة من الفئران في الغشاء المخاطي الشمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء بإعداد ثلاثة أطباق بتري 35 مم مملوءة DMEM / HAM مستنبت F12 في غطاء ثقافة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب الموافقة على أي وسيلة للقتل الرحيم مقدما عن طريق رعاية الحيوانات المؤسسة واستخدام لجنة ونفذت من قبل موظفين مؤهلين. بعد تخدير الفئران دخلت عميقة مع أشكال الصوديوم بنتوباربيتال حقن تخدير أو غيرها من مثل الكيتامين / زيلازين ، قطع رأس وإزالة الجلد. وينبغي تجنب التخدير الاستنشاق. وسيتم تقييم مدى كفاية تخدير بواسطة إصبع قرصة قبل قطع الرأس. إزالة الفك السفلي مع مقص ، وبمساعدة من قراضة ، والقضاء على عضلات الوجه على الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من الجزء الخلفي من القواطع ، مع إزالة مقراض العظم الذي يغطي تجويف الأنف ، جانب واحد في وقت واحد. والقرائن حيز البصر حاسة الشم والبرتقالي / البني الأجهزة الموجودة في الجزء الخلفي من الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بدقة على القرائن مع ملقط. باستخدام إبرة قياس 26 ، عزل الغشاء المخاطي الشمي ملقاة على الحاجز عن طريق قطع النسيج على ثلاثة خطوط : قوس عمودي لوحة ، لوحة المصفوية وسقف تجويف الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات للفحص في كلا الجانبين ونقلها في صحن DMEM / HAM بيتري F12 - شغلها. وينبغي أن هذا الإجراء لا تستغرق وقتا أطول من 10 دقيقة من بداية القتل الرحيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، من أجل إزالة المخاط ، نقل الخزعات مرتين في أطباق بتري المتوسطة شغلها. </li></ol> 2. مجموعة من البشر في الغشاء المخاطي الشمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يتم هذا الإجراء من قبل الأذن والأنف والحنجرة (ENT) جراح ، وفقا للجنة المحلية ذات الصلة الأخلاقية (ق) ، ويجب أن يوقع كل العيادات الخارجية نموذج الموافقة المستنيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ° 0 أو 30 درجة المنظار جامدة (4 مم) ، وفحص كل من تجاويف الأنف وتقييم وجود المفترضة من الاورام الحميدة أو أي آفة التهابية. اختيار أفضل تجويف الأنف ، مع الأخذ بعين الاعتبار انحراف الحاجز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قضيب من القطن ، وتطبيق مخدر موضعي ، مثل يدوكائين مع الادرينالين ، لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالملقط a throughcut الغربالي ، وجمع اثنين ملليمتر مربع خزعة إما في الجذر من الجانب الإنسي من المحارة المتوسطة أو على الحاجز في منطقة ظهراني إنسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقل خزعة الشمية ، وذلك باستخدام إبرة معقمة ، في أنبوب العقيمة 2 مل مملوءة 1 مل من DMEM / HAM F12. تقلب رأسا على عقب أنبوب للتأكد من أن يتم غمس خزعة في المتوسط ​​الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الانبوب في حاوية مبردة ونقلها إلى مختبر أبحاث. في هذه المرحلة ، يمكن أن تستخدم الخزعة في حد ذاتها للدراسات الجزيئية النسبية التي تركز على أمراض معينة أو معالجة الدماغ لتوليد الخلايا الجذعية. </li></ol> 3. عزل الخلايا الجذعية من الغشاء المخاطي الشمي الإنسان والفأر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخزعات في DMEM / HAM F12. احتضان الخزعات في طبق بتري مليئة 1 مل من dispase حل ثانيا (2.4 وحدة دولية / مل) ، لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، تحت مجهر تشريح بضوء diffracted مقلوب ، تتم إزالة الظهارة الشمية من الصفيحة المخصوصة الكامنة باستخدام ملعقة صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الظهارة الشمية هي أرق وتبدو شفافة على خلفية سوداء بالمقارنة مع الصفيحة المخصوصة التي هي مخططة البرتقالي / البني. على خلفية بيضاء ، وتبدو رمادية ظهارة وصفيحة المخصوصة ، والبني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المنقى مرة واحدة ، ونقل الصفيحة المخصوصة في طبق بتري مليئة DMEM / HAM F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان النسيج هو من القوارض ، ثم قطع الصفيحة المخصوصة الى قطع صغيرة مع اثنين من الإبر قياس 25. ثم ، ونقل القطع لأنبوب 15 مل مملوءة 1 مل من IA كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأنبوب ، وذلك باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة ، فصل الأنسجة. ثم احتضان الأنبوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنهاء الانفصال ، الصخرة بلطف أنبوب ويضاف 9 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم حرة وخالية من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية خلية في DMEM / HAM مستنبت F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية والثقافة لوحة على أطباق بلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، إذا كانت الأنسجة البشرية ، وشريحة ثم إلى الصفيحة المخصوصة 3-4 قطعة بسماكة تتراوح بين 200-500 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج كل قطاع الخاص في صحن قطره 2 سم الثقافة وتغطية الأنسجة عقيمة مع قطرها 1.3 سم ينزلق الغطاء الزجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم ، إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت (DMEM / HAM F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية) إلى كل صحن الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما لنوع الأنسجة ، وتجديد الثقافة المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خمسة إلى سبعة أيام بعد ، وسوف تبدأ الخلايا الجذعية لغزو الثقافة وطبق بعد أسبوعين أنها ينبغي أن تكون متموجة. عندما يتم التوصل confluency ، والمرور ، ونقل الخلايا إلى قوارير الثقافة. </li></ol> 4. تشكيل المجال واح متعلق بالخلايا العصبيةntiation من الخلايا الجذعية الشم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد مجالات الخلايا الجذعية ، واحتضان قوارير لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع بولي - L - يسين. (نص : 5 g/cm2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 16000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قوارير المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل يومين ، تغذية الخلايا مع 0.2ml لكل سنتيمتر مربع من المتوسط ​​تستكمل (DMEM / HAM F12 تستكمل مع الانسولين ، ترانسفيرين ، السيلينيوم (ITS - X ، 1 ٪) ، EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يومين إلى خمسة أيام في وقت لاحق ، وجمع المجالات الخلية عائمة وإما إعادة لوحة أو فصل منها قبل التطعيم في نماذج حيوانية لعلاج الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتمييز بين الخلايا الجذعية العصبية الشمية في مثل الخلايا ، بزراعتها لمدة 21 يوما في المتوسط ​​تحتوي على Neurobasal B - 27 ، البنسلين ، الستربتوميسين ، الجلوتامين والغلوتامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم جعل التغييرات المتوسط ​​كل 3 أيام. وينبغي أن الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا تظهر بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. </li></ol> 5. ممثل النتائج : الأنف البشري يزدرع - تعدى الخلايا الجذعية (الشكل 2A) هي تقسيم بسرعة ويمكن أن يتم التوصل في غضون confluency 1-2 أسابيع. تم تقييم احد السمات الرئيسية لstemness ، nestin التعبير ، (2B الشكل). عندما نمت على بولي يسين - L مع مستنبت المصل خالية تستكمل مع EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل) ، والخلايا الجذعية تثير حاسة الشم لتشمل المجالات (الشكل 2C). عندما نمت في مستنبت المحتوية على مصل المجالات مطلية حديثا تثير GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) أرقام تويولين الإعراب ، خلايا (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) 9 ( 2D - F). ومع ذلك ، يمكن تعديل مصير الخلايا المشتقة المجال. على سبيل المثال ، عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإن معظم الخلايا الجذعية العصبية الشمية في الأنف مثل الخلايا معربا عن β - III تويولين الشكل (2G) وMAP2 الشكل (2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. مخطط شامل للتجربة. يتم استئصال الغشاء المخاطي الشمي خزعات من الجرذان أو تجويف الأنف البشري. ويمكن استخدام Explants في حد ذاته للدراسات الجزيئية النسبية التي تهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية في أمراض الدماغ. لعزل الخلايا الجذعية الشمية ، تتعطل التفاعلات بين الصفيحة المخصوصة والاعصاب ظهارة ، مع انزيم dispase الثاني ، وبعد 45 دقيقة ، تتم إزالة الظهارة مع ملعقة صغيرة. ويتم اختيار المزيد من الخلايا الجذعية الشمية بواسطة القوارض عدم الربط بين الصفيحة المخصوصة مع IA كولاجيناز. للأنسجة البشرية ، ومثقف قطعة من الصفيحة المخصوصة الشمية ساترة تحت الزجاج حتى تعدى غزو الخلايا الجذعية كله جيدا. بعد الانتشار ، وذلك باستخدام وسيلة الثقافة المناسبة ، يمكن توليد الخلايا الجذعية الشمية أو تمييز في مجالات الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا. ويمكن استخدام الخلايا الجذعية لحاسة الشم ط) أمراض الدماغ أو إصلاح أو الصدمة الثانية) تحديد المؤشرات الجزيئية للأمراض الجهاز العصبي المركزي. تتم بمساعدة الرسوم التوضيحية للفنون Servier الطبية. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. الثقافة وتمايز الخلايا الجذعية البشرية الأنف حاسة الشم. الخلايا الجذعية البشرية المتزايدة من الصفيحة المخصوصة ازدراع (A) هي تقسيم بسرعة ، وعندما يزرع في وسط المحتوية على مصل. الخلايا الجذعية تعبر عن stemness nestin علامة (B). عندما مطلي على بولي - L - يسين المغلفة البلاستيكية وزراعتها في وسط ثقافة خالية من مصل EGF وتستكمل مع FGF2 ، والخلايا الجذعية مجالات توليد حاسة الشم (C). المجال المستمدة من الخلايا ، وعندما مطلي في مستنبت المحتوية على مصل الدم ، تؤدي إلى GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) ، معربا عن الخلايا تويولين - (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) 9 (مدافع). عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإنها تفرق في الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا معربا عن β - III تويولين (G) وMAP2 (H).

<ol>
	<li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons.">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li><li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett's+syndrome.">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li><li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+adhesion,+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia.">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li><li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific,+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders.">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li><li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease.">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li><li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+stem+cells,+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia.">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li><li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses.">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li><li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+olfactory+stem+cells.">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa.">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li><li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa.">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li><li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties.">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li><li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss.">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li><li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice.">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia:+a+3-year+clinical+trial.">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدم هنا تقنيات تجعل القوارض والغشاء المخاطي الشمي الإنسان نموذجا مفيدا للبحوث السريرية في أسباب الأمراض العصبية النمائية والاعصاب وكذلك أداة لإصلاح المرضية في الدماغ أو صدمة. بروتوكول واضح ومباشر نسبيا ويمكن حملها بسهولة من قبل ذوي الخبرة بيولوجيا الخلايا. نسبة النجاح لتقنيات خزعة والثقافة العالية. خطوات حاسمة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع الغشاء المخاطي الشمي القوارض ، فمن المستحسن أن لا تتجاوز مهلة من 10 دقيقة بين القتل الرحيم والاستئصال النهائي للأنسجة حاسة الشم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعادة ما يتحقق من التفكك الصفيحة المخصوصة القوارض الشمية بعد 10 دقيقة. حضانة في كولاجيناز IA. إذا لم يكن كذلك ، فإننا نوصي لجمع بعد يوم من طاف في بت undissociated التي تطفو من الصفيحة المخصوصة ، فإنه الطرد المركزي في 200 غ ، وتنأى ميكانيكيا الصفيحة العائمة باستخدام ماصة باستور قبل replating الخلايا في البئر الجديد. يمتلئ البئر الأول الذي يحتوي على خلايا تعلق بالفعل مع مستنبت الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصفيحة المخصوصة للبشرية ، الذي هو أكثر إحكاما من الأنسجة القوارض ، ونحن لا يوصي تفارق الأنزيمية. هي شرائح الأنسجة ويتم إدراج كل يزدرع بين الجزء السفلي من صحن البلاستيك والزجاج ساترة. الثقافات الناجحة التي تشمل explants سمك نطاق 200-500 ميكرون. </li></ul> التعديلات الممكنة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن للبروتوكول الحالي معدلة بشكل طفيف من أجل توليد خلايا عصبية شمية في المختبر. لهذا الغرض ، لا تتم إزالة العصبية وشرائح ظهارة الغشاء المخاطي الشمي كامل مع المروحية McIlwain (200 ميكرون سمك). غير مطلي كل يزدرع في طبق ، والمجففة جزئيا لمدة ساعة وبعد ذلك مع ممهى مستنبت المحتوية على السفح. خلال الأيام الأولى بعد الطلاء ، والخلايا الظهارية الوسيطة تنمو خارج ازدراع. ثم ، فإن أسلاف الخلايا العصبية الهجرة على رأس هذه الطبقة وتفرق في الخلية العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحقيق تنقية الخلايا الجذعية باستخدام حاسة الشم التدفق الخلوي. ويمكن استرجاع علامات سطح معينة من القائمة التي نشرت في ورقة خصائص 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب زرع ، فمن الممكن استخدام سلالة من الفئران التي الشمية الخلايا الجذعية هي GFP إيجابية. هذه السلالة الفئران (سبراغ داولي ، eGFP مدفوعا المروج PGK) متوفرا في ITERT (نانت الفرنسي). لإدخال هذا الجين في GFP الخلايا الجذعية البشرية حاسة الشم ، ونحن نستخدم أسلوب يستند على العدوى الفيروسة البطيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتركز هذه الورقة على حاسة الشم الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي. ومع ذلك ، يمكن تنقيته من نوع آخر خلية من الفائدة ، والخلايا الشمية مغمد ، من النسيج نفسه. صفنا طريقة لجمع وتنقية وكنا 1،17 الإنسان خلايا الأنف مغمد لمحاكمة I / الداخليين المرحلة السريرية في المرضى الذين مشلول 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بوصفه عضوا من الفصيلة الخلايا الجذعية الوسيطة ، OE - اللجان الدائمة قادرة ، في ظل ظروف مناسبة ثقافة ، للتمييز في osteocytes ، والخلايا الشحمية myocytes 11. </li></ul> التطبيقات المستقبلية <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد استخدمنا بالفعل الخزعات الشمية الإنسان لدراسة الحالات الشاذة الخلوية والجزيئية في المرضى الذين يعانون من التوحد ، واضطراب ثنائي القطب ، خلل الوظائف المستقلة العائلية ، ومرض باركنسون ومرض الزهايمر والفصام 2-7. نظريا ، يمكن أن تدرس جميع أمراض الدماغ باستخدام خزعات الأنف أو الخلايا الجذعية الطرفية الشمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القوارض والإنسان الخلايا الجذعية الشمية الأنفية وقد تم بالفعل المطعمة في النماذج الحيوانية من فقدان الذاكرة ومرض باركنسون ، والضرر القوقعة والحبل الشوكي الصدمة 12-16. ومن المتصور أن زرع هذه الخلايا في النماذج الحيوانية لمرض الزهايمر ، ونقص تروية الدماغ ، والتصلب المتعدد. </li></ul>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td colspan="3"> مجموعة من الغشاء المخاطي الشمي في الفئران </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> بنتوباربيتال الصوديوم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مقراض </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> إبرة قياس 26 </td><td> Terumo </td><td> NN - 2613R </td></tr><tr><td> ملقط </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> مجموعة من الغشاء المخاطي الشمي في البشر </td></tr><tr><td> جامدة المنظار </td><td> كارل ستورز أو ريتشارد وولف الطبية </td><td></td></tr><tr><td> يدوكائين </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الإيبينيفرين </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut الغربالي ملقط </td><td> كارل ستورز أو ريتشارد وولف الطبية </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> عزل الخلايا الجذعية الشمية </td></tr><tr><td> Dispase الثاني </td><td> روش </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الملعقة الصغيرة </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز IA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> ساترة زجاجية </td><td> Knittel جلاسر </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> تشكيل المجال وتمايز الخلايا العصبية </td></tr><tr><td> بولي - L - يسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P - 1274 </td></tr><tr><td> الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D نظم </td><td> 236 - EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D نظم </td><td> 233 - FB </td></tr><tr><td> Neurobasal المتوسطة </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B - 27 المصل خالية من الملحق </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> الجلوتامين </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> الغلوتامات </td><td> سيغما الدريخ </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

الغشاء المخاطي الشمي ، وتقع في تجويف الأنف ، هو المسؤول عن كشف الروائح. بل هو أيضا النسيج العصبي الوحيد الذي يتعرض إلى البيئة الخارجية ، ويمكن الوصول إليها بسهولة في كل فرد المعيشة. نتيجة لذلك ، هذا النسيج هي فريدة من نوعها لأحد تهدف الى تحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ المرضية أو عزل الخلايا الجذعية البالغة لعلاج الخلايا. غالبا ما تتم دراسة حالة شذوذ الجزيئية في أمراض الدماغ باستخدام عينات الأنسجة العصبية التي تم جمعها بعد الوفاة. ومع ذلك ، هذه المواد وقيود عديدة. في المقابل ، فإن الغشاء المخاطي الشمي يمكن الوصول إليها بسهولة ، ويمكن أن تحتاج فحص بأمان دون أي خسارة في حاسة الشم 1. تبعا لذلك ، والغشاء المخاطي الشمي يوفر &quot;نافذة مفتوحة&quot; في الإنسان البالغ من خلالها يمكن للمرء أن الدراسة التنموية (مثل التوحد وانفصام الشخصية) 2-4 أو الاعصاب (باركنسون مثل الزهايمر) 4،5 الأمراض. ويمكن استخدام الغشاء المخاطي الشمي للدراسات المقارنة إما الجزيئية أو 4،6 في التجارب المختبرية على تكوين الخلايا العصبية 3،7. الظهارة الشمية أيضا الأنسجة العصبية التي تنتج خلايا عصبية جديدة كل يوم لتحل محل تلك التي تضررت من التلوث ، والبكتيرية من الالتهابات الفيروسية. ويستمر هذا تكوين الخلايا العصبية الدائمة الأسلاف ولكن أيضا الخلايا الجذعية المقيمين على حد سواء داخل المقصورات في الغشاء المخاطي ، وهما والظهارة العصبية الكامنة الصفيحة المخصوصة 80-10. نحن وضعت مؤخرا طريقة لتنقية الخلايا الجذعية الموجودة في الصفيحة المخصوصة ، وبعد أن أثبتت أن ترتبط ارتباطا وثيقا لأنها خلايا نخاع العظام الجذعية الوسيطة (BM - MSC) ، ونحن منهم اسمه الشمية الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي (OE - MSC) 11. ومن المثير للاهتمام ، بالمقارنة مع BM - اللجان الدائمة ، اللجان الدائمة OE - عرض معدل انتشار عالية ، وهو clonogenicity مرتفعة وميله الى التمايز إلى خلايا عصبية. اتخذنا الاستفادة من هذه الخصائص لتنفيذ دراسات مخصصة لكشف النقاب عن الجينات المرشحة الجديدة في الفصام و 4 مرض باركنسون. وقد أظهرت نحن وغيرنا أيضا أن OE - اللجان الدائمة واعدة المرشحين للعلاج الخلايا ، وبعد صدمة الحبل الشوكي 12،13 ، 14 قوقعة ضرر أو في النماذج الحيوانية لمرض الشلل الرعاش 15 أو فقدان الذاكرة 16. في هذه الدراسة ، فإننا نقدم طرق لخزعة الغشاء المخاطي الشمي في الفئران والبشر. بعد جمع ، يتم فصل إنزيمي في الصفيحة المخصوصة من ظهارة والخلايا الجذعية هي تنقية باستخدام الأنزيمية أو أسلوب غير الأنزيمية. يمكن تنقية الخلايا الجذعية تكون حاسة الشم ثم نمت إما بأعداد كبيرة ، واعتمدت في النيتروجين السائل أو حثهم على شكل دوائر أو متمايزة في الخلايا العصبية. ويمكن أيضا أن تكون هذه الخلايا الجذعية المستخدمة في omics المقارن (الجينوم ، transcriptomic ، epigenomic ، البروتين) دراسات.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans at JoVE.com

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

نحن هنا تصف طريقة لbiopsying المخاطية الشمية من الفئران والجيوب الأنفية الإنسان. ويمكن استخدام هذه الخزعات إما لتحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ أو أمراض multipotent عزل الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها لزرع الخلايا في النماذج الحيوانية من الصدمة الدماغ / المرض.

عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

القياسات الكهربية من نظام العثة الشم

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

وهناك طريقة توسيع المركب-ينطبق على مجاميع من العصبية الجذعية البشرية والخلايا المشتقة من الخلايا السلف الجذعية المحفزة أو الجنين أنسجة المخ

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

الخلايا العصبية الشمية التي يتم الحصول عليها من خلال الأنف خزعة جنبا إلى جنب مع الليزر والتقاط تسليخ مجهري: نهج المحتملين لدراسة الاستجابة للعلاج في اضطرابات العقلية

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...