Name: isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans at JoVE.com

وأيد هذا العمل ماليا ANR (وكالة الأنباء الوطنية دي لا بحوث) ، فؤاد (رابطة مناهضة الفرنسية ليه الاعتلالات العضلية) ، وفيدر في PACA IRME (معهد بحوث سور دي لا Moelle épinière آخرون L&#39; دماغ). نشكر بامتنان ماري بيير بلانشار (جان روش معهد) ليساعدها على كفاءة أثناء تسجيل مرور الوقت.

1. مجموعة من الفئران في الغشاء المخاطي الشمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء بإعداد ثلاثة أطباق بتري 35 مم مملوءة DMEM / HAM مستنبت F12 في غطاء ثقافة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب الموافقة على أي وسيلة للقتل الرحيم مقدما عن طريق رعاية الحيوانات المؤسسة واستخدام لجنة ونفذت من قبل موظفين مؤهلين. بعد تخدير الفئران دخلت عميقة مع أشكال الصوديوم بنتوباربيتال حقن تخدير أو غيرها من مثل الكيتامين / زيلازين ، قطع رأس وإزالة الجلد. وينبغي تجنب التخدير الاستنشاق. وسيتم تقييم مدى كفاية تخدير بواسطة إصبع قرصة قبل قطع الرأس. إزالة الفك السفلي مع مقص ، وبمساعدة من قراضة ، والقضاء على عضلات الوجه على الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من الجزء الخلفي من القواطع ، مع إزالة مقراض العظم الذي يغطي تجويف الأنف ، جانب واحد في وقت واحد. والقرائن حيز البصر حاسة الشم والبرتقالي / البني الأجهزة الموجودة في الجزء الخلفي من الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بدقة على القرائن مع ملقط. باستخدام إبرة قياس 26 ، عزل الغشاء المخاطي الشمي ملقاة على الحاجز عن طريق قطع النسيج على ثلاثة خطوط : قوس عمودي لوحة ، لوحة المصفوية وسقف تجويف الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات للفحص في كلا الجانبين ونقلها في صحن DMEM / HAM بيتري F12 - شغلها. وينبغي أن هذا الإجراء لا تستغرق وقتا أطول من 10 دقيقة من بداية القتل الرحيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، من أجل إزالة المخاط ، نقل الخزعات مرتين في أطباق بتري المتوسطة شغلها. </li></ol> 2. مجموعة من البشر في الغشاء المخاطي الشمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يتم هذا الإجراء من قبل الأذن والأنف والحنجرة (ENT) جراح ، وفقا للجنة المحلية ذات الصلة الأخلاقية (ق) ، ويجب أن يوقع كل العيادات الخارجية نموذج الموافقة المستنيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ° 0 أو 30 درجة المنظار جامدة (4 مم) ، وفحص كل من تجاويف الأنف وتقييم وجود المفترضة من الاورام الحميدة أو أي آفة التهابية. اختيار أفضل تجويف الأنف ، مع الأخذ بعين الاعتبار انحراف الحاجز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قضيب من القطن ، وتطبيق مخدر موضعي ، مثل يدوكائين مع الادرينالين ، لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالملقط a throughcut الغربالي ، وجمع اثنين ملليمتر مربع خزعة إما في الجذر من الجانب الإنسي من المحارة المتوسطة أو على الحاجز في منطقة ظهراني إنسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقل خزعة الشمية ، وذلك باستخدام إبرة معقمة ، في أنبوب العقيمة 2 مل مملوءة 1 مل من DMEM / HAM F12. تقلب رأسا على عقب أنبوب للتأكد من أن يتم غمس خزعة في المتوسط ​​الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الانبوب في حاوية مبردة ونقلها إلى مختبر أبحاث. في هذه المرحلة ، يمكن أن تستخدم الخزعة في حد ذاتها للدراسات الجزيئية النسبية التي تركز على أمراض معينة أو معالجة الدماغ لتوليد الخلايا الجذعية. </li></ol> 3. عزل الخلايا الجذعية من الغشاء المخاطي الشمي الإنسان والفأر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخزعات في DMEM / HAM F12. احتضان الخزعات في طبق بتري مليئة 1 مل من dispase حل ثانيا (2.4 وحدة دولية / مل) ، لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، تحت مجهر تشريح بضوء diffracted مقلوب ، تتم إزالة الظهارة الشمية من الصفيحة المخصوصة الكامنة باستخدام ملعقة صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الظهارة الشمية هي أرق وتبدو شفافة على خلفية سوداء بالمقارنة مع الصفيحة المخصوصة التي هي مخططة البرتقالي / البني. على خلفية بيضاء ، وتبدو رمادية ظهارة وصفيحة المخصوصة ، والبني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المنقى مرة واحدة ، ونقل الصفيحة المخصوصة في طبق بتري مليئة DMEM / HAM F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان النسيج هو من القوارض ، ثم قطع الصفيحة المخصوصة الى قطع صغيرة مع اثنين من الإبر قياس 25. ثم ، ونقل القطع لأنبوب 15 مل مملوءة 1 مل من IA كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأنبوب ، وذلك باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة ، فصل الأنسجة. ثم احتضان الأنبوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنهاء الانفصال ، الصخرة بلطف أنبوب ويضاف 9 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم حرة وخالية من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية خلية في DMEM / HAM مستنبت F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية والثقافة لوحة على أطباق بلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، إذا كانت الأنسجة البشرية ، وشريحة ثم إلى الصفيحة المخصوصة 3-4 قطعة بسماكة تتراوح بين 200-500 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج كل قطاع الخاص في صحن قطره 2 سم الثقافة وتغطية الأنسجة عقيمة مع قطرها 1.3 سم ينزلق الغطاء الزجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم ، إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت (DMEM / HAM F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية) إلى كل صحن الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما لنوع الأنسجة ، وتجديد الثقافة المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خمسة إلى سبعة أيام بعد ، وسوف تبدأ الخلايا الجذعية لغزو الثقافة وطبق بعد أسبوعين أنها ينبغي أن تكون متموجة. عندما يتم التوصل confluency ، والمرور ، ونقل الخلايا إلى قوارير الثقافة. </li></ol> 4. تشكيل المجال واح متعلق بالخلايا العصبيةntiation من الخلايا الجذعية الشم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد مجالات الخلايا الجذعية ، واحتضان قوارير لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع بولي - L - يسين. (نص : 5 g/cm2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 16000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قوارير المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل يومين ، تغذية الخلايا مع 0.2ml لكل سنتيمتر مربع من المتوسط ​​تستكمل (DMEM / HAM F12 تستكمل مع الانسولين ، ترانسفيرين ، السيلينيوم (ITS - X ، 1 ٪) ، EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يومين إلى خمسة أيام في وقت لاحق ، وجمع المجالات الخلية عائمة وإما إعادة لوحة أو فصل منها قبل التطعيم في نماذج حيوانية لعلاج الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتمييز بين الخلايا الجذعية العصبية الشمية في مثل الخلايا ، بزراعتها لمدة 21 يوما في المتوسط ​​تحتوي على Neurobasal B - 27 ، البنسلين ، الستربتوميسين ، الجلوتامين والغلوتامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم جعل التغييرات المتوسط ​​كل 3 أيام. وينبغي أن الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا تظهر بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. </li></ol> 5. ممثل النتائج : الأنف البشري يزدرع - تعدى الخلايا الجذعية (الشكل 2A) هي تقسيم بسرعة ويمكن أن يتم التوصل في غضون confluency 1-2 أسابيع. تم تقييم احد السمات الرئيسية لstemness ، nestin التعبير ، (2B الشكل). عندما نمت على بولي يسين - L مع مستنبت المصل خالية تستكمل مع EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل) ، والخلايا الجذعية تثير حاسة الشم لتشمل المجالات (الشكل 2C). عندما نمت في مستنبت المحتوية على مصل المجالات مطلية حديثا تثير GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) أرقام تويولين الإعراب ، خلايا (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) 9 ( 2D - F). ومع ذلك ، يمكن تعديل مصير الخلايا المشتقة المجال. على سبيل المثال ، عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإن معظم الخلايا الجذعية العصبية الشمية في الأنف مثل الخلايا معربا عن β - III تويولين الشكل (2G) وMAP2 الشكل (2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. مخطط شامل للتجربة. يتم استئصال الغشاء المخاطي الشمي خزعات من الجرذان أو تجويف الأنف البشري. ويمكن استخدام Explants في حد ذاته للدراسات الجزيئية النسبية التي تهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية في أمراض الدماغ. لعزل الخلايا الجذعية الشمية ، تتعطل التفاعلات بين الصفيحة المخصوصة والاعصاب ظهارة ، مع انزيم dispase الثاني ، وبعد 45 دقيقة ، تتم إزالة الظهارة مع ملعقة صغيرة. ويتم اختيار المزيد من الخلايا الجذعية الشمية بواسطة القوارض عدم الربط بين الصفيحة المخصوصة مع IA كولاجيناز. للأنسجة البشرية ، ومثقف قطعة من الصفيحة المخصوصة الشمية ساترة تحت الزجاج حتى تعدى غزو الخلايا الجذعية كله جيدا. بعد الانتشار ، وذلك باستخدام وسيلة الثقافة المناسبة ، يمكن توليد الخلايا الجذعية الشمية أو تمييز في مجالات الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا. ويمكن استخدام الخلايا الجذعية لحاسة الشم ط) أمراض الدماغ أو إصلاح أو الصدمة الثانية) تحديد المؤشرات الجزيئية للأمراض الجهاز العصبي المركزي. تتم بمساعدة الرسوم التوضيحية للفنون Servier الطبية. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. الثقافة وتمايز الخلايا الجذعية البشرية الأنف حاسة الشم. الخلايا الجذعية البشرية المتزايدة من الصفيحة المخصوصة ازدراع (A) هي تقسيم بسرعة ، وعندما يزرع في وسط المحتوية على مصل. الخلايا الجذعية تعبر عن stemness nestin علامة (B). عندما مطلي على بولي - L - يسين المغلفة البلاستيكية وزراعتها في وسط ثقافة خالية من مصل EGF وتستكمل مع FGF2 ، والخلايا الجذعية مجالات توليد حاسة الشم (C). المجال المستمدة من الخلايا ، وعندما مطلي في مستنبت المحتوية على مصل الدم ، تؤدي إلى GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) ، معربا عن الخلايا تويولين - (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) 9 (مدافع). عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإنها تفرق في الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا معربا عن β - III تويولين (G) وMAP2 (H).

<ol>
	<li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons.">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li><li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett's+syndrome.">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li><li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+adhesion,+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia.">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li><li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific,+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders.">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li><li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease.">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li><li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+stem+cells,+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia.">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li><li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses.">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li><li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+olfactory+stem+cells.">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa.">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li><li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa.">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li><li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties.">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li><li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss.">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li><li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice.">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia:+a+3-year+clinical+trial.">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدم هنا تقنيات تجعل القوارض والغشاء المخاطي الشمي الإنسان نموذجا مفيدا للبحوث السريرية في أسباب الأمراض العصبية النمائية والاعصاب وكذلك أداة لإصلاح المرضية في الدماغ أو صدمة. بروتوكول واضح ومباشر نسبيا ويمكن حملها بسهولة من قبل ذوي الخبرة بيولوجيا الخلايا. نسبة النجاح لتقنيات خزعة والثقافة العالية. خطوات حاسمة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع الغشاء المخاطي الشمي القوارض ، فمن المستحسن أن لا تتجاوز مهلة من 10 دقيقة بين القتل الرحيم والاستئصال النهائي للأنسجة حاسة الشم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعادة ما يتحقق من التفكك الصفيحة المخصوصة القوارض الشمية بعد 10 دقيقة. حضانة في كولاجيناز IA. إذا لم يكن كذلك ، فإننا نوصي لجمع بعد يوم من طاف في بت undissociated التي تطفو من الصفيحة المخصوصة ، فإنه الطرد المركزي في 200 غ ، وتنأى ميكانيكيا الصفيحة العائمة باستخدام ماصة باستور قبل replating الخلايا في البئر الجديد. يمتلئ البئر الأول الذي يحتوي على خلايا تعلق بالفعل مع مستنبت الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصفيحة المخصوصة للبشرية ، الذي هو أكثر إحكاما من الأنسجة القوارض ، ونحن لا يوصي تفارق الأنزيمية. هي شرائح الأنسجة ويتم إدراج كل يزدرع بين الجزء السفلي من صحن البلاستيك والزجاج ساترة. الثقافات الناجحة التي تشمل explants سمك نطاق 200-500 ميكرون. </li></ul> التعديلات الممكنة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن للبروتوكول الحالي معدلة بشكل طفيف من أجل توليد خلايا عصبية شمية في المختبر. لهذا الغرض ، لا تتم إزالة العصبية وشرائح ظهارة الغشاء المخاطي الشمي كامل مع المروحية McIlwain (200 ميكرون سمك). غير مطلي كل يزدرع في طبق ، والمجففة جزئيا لمدة ساعة وبعد ذلك مع ممهى مستنبت المحتوية على السفح. خلال الأيام الأولى بعد الطلاء ، والخلايا الظهارية الوسيطة تنمو خارج ازدراع. ثم ، فإن أسلاف الخلايا العصبية الهجرة على رأس هذه الطبقة وتفرق في الخلية العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحقيق تنقية الخلايا الجذعية باستخدام حاسة الشم التدفق الخلوي. ويمكن استرجاع علامات سطح معينة من القائمة التي نشرت في ورقة خصائص 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب زرع ، فمن الممكن استخدام سلالة من الفئران التي الشمية الخلايا الجذعية هي GFP إيجابية. هذه السلالة الفئران (سبراغ داولي ، eGFP مدفوعا المروج PGK) متوفرا في ITERT (نانت الفرنسي). لإدخال هذا الجين في GFP الخلايا الجذعية البشرية حاسة الشم ، ونحن نستخدم أسلوب يستند على العدوى الفيروسة البطيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتركز هذه الورقة على حاسة الشم الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي. ومع ذلك ، يمكن تنقيته من نوع آخر خلية من الفائدة ، والخلايا الشمية مغمد ، من النسيج نفسه. صفنا طريقة لجمع وتنقية وكنا 1،17 الإنسان خلايا الأنف مغمد لمحاكمة I / الداخليين المرحلة السريرية في المرضى الذين مشلول 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بوصفه عضوا من الفصيلة الخلايا الجذعية الوسيطة ، OE - اللجان الدائمة قادرة ، في ظل ظروف مناسبة ثقافة ، للتمييز في osteocytes ، والخلايا الشحمية myocytes 11. </li></ul> التطبيقات المستقبلية <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد استخدمنا بالفعل الخزعات الشمية الإنسان لدراسة الحالات الشاذة الخلوية والجزيئية في المرضى الذين يعانون من التوحد ، واضطراب ثنائي القطب ، خلل الوظائف المستقلة العائلية ، ومرض باركنسون ومرض الزهايمر والفصام 2-7. نظريا ، يمكن أن تدرس جميع أمراض الدماغ باستخدام خزعات الأنف أو الخلايا الجذعية الطرفية الشمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القوارض والإنسان الخلايا الجذعية الشمية الأنفية وقد تم بالفعل المطعمة في النماذج الحيوانية من فقدان الذاكرة ومرض باركنسون ، والضرر القوقعة والحبل الشوكي الصدمة 12-16. ومن المتصور أن زرع هذه الخلايا في النماذج الحيوانية لمرض الزهايمر ، ونقص تروية الدماغ ، والتصلب المتعدد. </li></ul>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td colspan="3"> مجموعة من الغشاء المخاطي الشمي في الفئران </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> بنتوباربيتال الصوديوم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مقراض </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> إبرة قياس 26 </td><td> Terumo </td><td> NN - 2613R </td></tr><tr><td> ملقط </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> مجموعة من الغشاء المخاطي الشمي في البشر </td></tr><tr><td> جامدة المنظار </td><td> كارل ستورز أو ريتشارد وولف الطبية </td><td></td></tr><tr><td> يدوكائين </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الإيبينيفرين </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut الغربالي ملقط </td><td> كارل ستورز أو ريتشارد وولف الطبية </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> عزل الخلايا الجذعية الشمية </td></tr><tr><td> Dispase الثاني </td><td> روش </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الملعقة الصغيرة </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز IA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> ساترة زجاجية </td><td> Knittel جلاسر </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> تشكيل المجال وتمايز الخلايا العصبية </td></tr><tr><td> بولي - L - يسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P - 1274 </td></tr><tr><td> الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D نظم </td><td> 236 - EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D نظم </td><td> 233 - FB </td></tr><tr><td> Neurobasal المتوسطة </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B - 27 المصل خالية من الملحق </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> الجلوتامين </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> الغلوتامات </td><td> سيغما الدريخ </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

الغشاء المخاطي الشمي ، وتقع في تجويف الأنف ، هو المسؤول عن كشف الروائح. بل هو أيضا النسيج العصبي الوحيد الذي يتعرض إلى البيئة الخارجية ، ويمكن الوصول إليها بسهولة في كل فرد المعيشة. نتيجة لذلك ، هذا النسيج هي فريدة من نوعها لأحد تهدف الى تحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ المرضية أو عزل الخلايا الجذعية البالغة لعلاج الخلايا. غالبا ما تتم دراسة حالة شذوذ الجزيئية في أمراض الدماغ باستخدام عينات الأنسجة العصبية التي تم جمعها بعد الوفاة. ومع ذلك ، هذه المواد وقيود عديدة. في المقابل ، فإن الغشاء المخاطي الشمي يمكن الوصول إليها بسهولة ، ويمكن أن تحتاج فحص بأمان دون أي خسارة في حاسة الشم 1. تبعا لذلك ، والغشاء المخاطي الشمي يوفر &quot;نافذة مفتوحة&quot; في الإنسان البالغ من خلالها يمكن للمرء أن الدراسة التنموية (مثل التوحد وانفصام الشخصية) 2-4 أو الاعصاب (باركنسون مثل الزهايمر) 4،5 الأمراض. ويمكن استخدام الغشاء المخاطي الشمي للدراسات المقارنة إما الجزيئية أو 4،6 في التجارب المختبرية على تكوين الخلايا العصبية 3،7. الظهارة الشمية أيضا الأنسجة العصبية التي تنتج خلايا عصبية جديدة كل يوم لتحل محل تلك التي تضررت من التلوث ، والبكتيرية من الالتهابات الفيروسية. ويستمر هذا تكوين الخلايا العصبية الدائمة الأسلاف ولكن أيضا الخلايا الجذعية المقيمين على حد سواء داخل المقصورات في الغشاء المخاطي ، وهما والظهارة العصبية الكامنة الصفيحة المخصوصة 80-10. نحن وضعت مؤخرا طريقة لتنقية الخلايا الجذعية الموجودة في الصفيحة المخصوصة ، وبعد أن أثبتت أن ترتبط ارتباطا وثيقا لأنها خلايا نخاع العظام الجذعية الوسيطة (BM - MSC) ، ونحن منهم اسمه الشمية الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي (OE - MSC) 11. ومن المثير للاهتمام ، بالمقارنة مع BM - اللجان الدائمة ، اللجان الدائمة OE - عرض معدل انتشار عالية ، وهو clonogenicity مرتفعة وميله الى التمايز إلى خلايا عصبية. اتخذنا الاستفادة من هذه الخصائص لتنفيذ دراسات مخصصة لكشف النقاب عن الجينات المرشحة الجديدة في الفصام و 4 مرض باركنسون. وقد أظهرت نحن وغيرنا أيضا أن OE - اللجان الدائمة واعدة المرشحين للعلاج الخلايا ، وبعد صدمة الحبل الشوكي 12،13 ، 14 قوقعة ضرر أو في النماذج الحيوانية لمرض الشلل الرعاش 15 أو فقدان الذاكرة 16. في هذه الدراسة ، فإننا نقدم طرق لخزعة الغشاء المخاطي الشمي في الفئران والبشر. بعد جمع ، يتم فصل إنزيمي في الصفيحة المخصوصة من ظهارة والخلايا الجذعية هي تنقية باستخدام الأنزيمية أو أسلوب غير الأنزيمية. يمكن تنقية الخلايا الجذعية تكون حاسة الشم ثم نمت إما بأعداد كبيرة ، واعتمدت في النيتروجين السائل أو حثهم على شكل دوائر أو متمايزة في الخلايا العصبية. ويمكن أيضا أن تكون هذه الخلايا الجذعية المستخدمة في omics المقارن (الجينوم ، transcriptomic ، epigenomic ، البروتين) دراسات.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans at JoVE.com

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

نحن هنا تصف طريقة لbiopsying المخاطية الشمية من الفئران والجيوب الأنفية الإنسان. ويمكن استخدام هذه الخزعات إما لتحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ أو أمراض multipotent عزل الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها لزرع الخلايا في النماذج الحيوانية من الصدمة الدماغ / المرض.

عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

القياسات الكهربية من نظام العثة الشم

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

وهناك طريقة توسيع المركب-ينطبق على مجاميع من العصبية الجذعية البشرية والخلايا المشتقة من الخلايا السلف الجذعية المحفزة أو الجنين أنسجة المخ

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

الخلايا العصبية الشمية التي يتم الحصول عليها من خلال الأنف خزعة جنبا إلى جنب مع الليزر والتقاط تسليخ مجهري: نهج المحتملين لدراسة الاستجابة للعلاج في اضطرابات العقلية

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

تنقية Prominin-1+ الخلايا الجذعية من المخيخ الماوس بعد الولادة

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...