Name: isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans at JoVE.com

Dit werk werd financieel ondersteund door ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathie), Feder in PACA en IRME (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale). We dankbaar danken Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Instituut) voor haar een efficiënte hulp tijdens time lapse opname.

1. Het verzamelen van Olfactorische slijmvlies in ratten <ol><li> Begin met het opstellen van drie 35 mm petrischalen gevuld met DMEM / HAM F12 kweekmedium in een schone cultuur kap. </li><li> Een methode van euthanasie moet vooraf worden goedgekeurd door dier van de instelling zorg en het gebruik commissie en uitgevoerd door gekwalificeerd personeel. Nadat de rat is aangegaan diepe narcose met natrium-pentobarbital of andere injecteerbare vormen van anesthesie, zoals ketamine / xylazine, onthoofden en verwijder de huid. Inhalatieoplossing anesthetica moeten worden vermeden. Toereikendheid van de anesthesie zal worden beoordeeld door de teen knijpen voorafgaand aan de onthoofding. Verwijder de onderkaak met een schaar en met de hulp van een rongeur, elimineren de gelaatsspieren aan beide zijden. </li><li> Vanaf de achterkant van de snijtanden, verwijderen met een rongeur het bot met betrekking tot de neusholte, een kant tegelijk. De olfactorische neusschelpen komen in zicht als oranje / bruin organen zich in de achterkant van de neus. </li><li> Voorzichtig verwijderen van de neusschelpen met een pincet. Met behulp van een 26 gauge naald, de oorzaak van het olfactorische slijmvlies liggend op het septum door te snijden van het weefsel langs drie lijnen: de boog van de loodrechte plaat, de getralied plaat en het plafond van de neusholte. </li><li> Verzamel biopsies aan beide kanten en zet ze in een DMEM / HAM F12 gevulde petrischaal. Deze procedure mag niet langer duren dan 10 minuten van het begin euthanasie. </li><li> Nu, om het slijm te verwijderen, overdracht van de biopten twee keer in het midden-gevulde petrischalen. </li></ol> 2. Het verzamelen van Olfactorische slijmvlies bij mensen <ol><li> Deze procedure moet worden uitgevoerd door een Oor Neus en Keel (KNO) chirurg, in overeenstemming met de relevante lokale ethische commissie (s), en iedere polikliniek moet een informed consent formulier ondertekenen. </li><li> Met behulp van een 0 ° of 30 ° stijve endoscoop (4 mm diameter), controleer beide neusholten en beoordeling van de vermeende aanwezigheid van poliepen of een inflammatoire laesie. Kies de beste neusholte, rekening houdend met de afwijking van het septum. </li><li> Met behulp van een katoenen applicator, toepassen van een plaatselijke verdoving, zoals lidocaïne met adrenaline, gedurende 10 minuten. </li><li> Met een throughcut ethmoid tang, hetzij bij een twee vierkante millimeter biopsie aan de wortel van de mediale aspect van de middelste turbinate of op het septum in het dorsomediale gebied. </li><li> De olfactorische biopsie wordt dan overgebracht, met een steriele naald, in een steriele 2 ml buis gevuld met 1 ml DMEM / HAM F12. Tip de buis ondersteboven om ervoor te zorgen dat de biopsie wordt ondergedompeld in het kweekmedium. </li><li> Steek de buis in een gekoelde container en het transport naar het onderzoekslaboratorium. In dit stadium kan de biopsie worden gebruikt per se voor vergelijkende moleculaire studies gericht zijn op specifieke hersenaandoeningen of verwerkt voor het genereren van stamcellen. </li></ol> 3. Isolatie van Olfactorische stamcellen uit menselijke en Rat slijmvlies <ol><li> Was de biopten in DMEM / HAM F12. Incubeer de biopten in een petrischaal gevuld met 1 ml van dispase II-oplossing (2,4 IU / ml), gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Vervolgens onder een microscoop met dissectie een gebogen omgekeerd licht, is het reukepitheel verwijderd van de onderliggende lamina propria met behulp van een micro-spatel. </li><li> Het reukepitheel is dunner en ziet er translucent over een zwarte achtergrond in vergelijking met de lamina propria die is gestreept oranje / bruin. Over een witte achtergrond, het epitheel ziet er grijs en de lamina propria, bruin. </li><li> Eenmaal gezuiverd, overdracht van de lamina propria in een petrischaal gevuld met DMEM / HAM F12. </li><li> Als het weefsel is van een knaagdier, knip dan de lamina propria in kleine stukjes met twee 25 gauge naalden. Dan overdracht van de stukken om een ​​15 ml buis gevuld met 1 ml collagenase IA. </li><li> In de buis, met behulp van een steriele plastic pipet, dissociëren het weefsel. Vervolgens wordt de buis incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Tot beëindiging van de dissociatie, schud de buis en voeg 9 ml Ca-Mg-vrij en vrij PBS en centrifugeer bij 200 g gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de celpellet in DMEM / HAM F12 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalf serum, antibiotica en de plaat op plastic cultuur gerechten. </li><li> Nu, als het weefsel mens is, dan snijd de lamina propria in 3 tot 4 stukken met een dikte van 200 tot 500 pm. </li><li> Steek elke strip in een eigen 2 cm diameter cultuur schotel en bedek het weefsel met steriele 1,3 cm diameter glazen dekglaasjes. </li><li> Dan, voeg 500 ul kweekmedium (DMEM / HAM F12 aangevuld met 10% foetaal kalf serum en antibiotica) om elke cultuur gerecht. </li><li> Voor beide weefsel type, vernieuwen van de cultuur medium om de 2 tot 3 dagen. </li><li> Vijf tot zeven dagen na, zal stamcellen beginnen met de cultuur schotel binnen te vallen en na twee weken moeten ze worden confluent. Wanneer confluentie bereikt is, passage en de overdracht van de cellen aan de cultuur kolven. </li></ol> 4. Sphere Vorming en neuronale Differentiation van olfactorische Stem Cells <ol><li> Voor het genereren van stamcellen bollen, incubeer de kolven gedurende twee uur bij 37 ° C met poly-L-lysine. (TEXT: 5 g/cm2). </li><li> Het bord van de cellen bij een dichtheid van 16.000 cellen per vierkante centimeter in de behandelde kolven. </li><li> Om de twee dagen, voeden de cellen met 0,2 ml per vierkante centimeter aangevuld medium (DMEM / HAM F12 aangevuld met insuline, transferrine, selenium (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) en FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> Twee tot vijf dagen later, het verzamelen van drijvend cel sferen en een re-plaat of losmaken voordat enten in diermodellen van celtherapie. </li><li> Om onderscheid te olfactorische stamcellen in neuron-achtige cellen, kweken ze gedurende 21 dagen in Neurobasal medium met B-27, penicilline, streptomycine, glutamine en glutamaat. </li><li> Maak medium verandert elke drie dagen. Neuron-achtige cellen zou moeten verschijnen na twee tot drie weken. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Neus menselijke explant-ontgroeien stamcellen (Figuur 2A) zijn snel delende en confluentie kunnen bereiken binnen een tot twee weken. Een belangrijk kenmerk van stemness, Nestin expressie, werd geëvalueerd (figuur 2B). Wanneer gekweekt op poly-L-lysine met een serum-vrij kweekmedium aangevuld met EGF (50 ng / ml) en FGF2 (50 ng / ml), olfactorische stamcellen aanleiding geven tot bollen (figuur 2C). Wanneer ze groeien in serum-bevattend kweekmedium nieuw vergulde bollen aanleiding geven tot GFAP expressie cellen (~ 50%), tubuline expressie cellen (~ 10-15%) en O4 expressie cellen (~ 2-5%) 9 (Cijfers 2D-F). Kan echter het lot van de bol-afgeleide cellen worden aangepast. Bijvoorbeeld, wanneer ze groeien in een Neurobasal kweekmedium aangevuld met B27 en glutamaat, het grootste deel van de nasale olfactorische stamcellen in neuron-achtige cellen die β-tubuline III (figuur 2G) en MAP2 (figuur 2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Algehele opzet van het experiment. Olfactorische slijmvlies biopten worden uitgesneden uit rat of menselijke neusholte. Explanten kan worden gebruikt per se voor vergelijkende moleculaire studies gericht op biomarkers bij hersenziekten te identificeren. Voor het isoleren van olfactorische stamcellen, zijn de interacties tussen de lamina propria en de neuro-epitheel verstoord met de dispase II enzym, en na 45 minuten, het epitheel wordt verwijderd met een micro-spatel. Knaagdier olfactorische stamcellen worden verder geselecteerd door dissociatie van de lamina propria met collagenase IA. Voor menselijk weefsel, zijn stukjes van olfactorische lamina propria gekweekt onder glas dekglaasje totdat ontgroeien stamcellen binnen te dringen het geheel goed. Na de proliferatie, met behulp van een geschikt kweekmedium, kan olfactorische stamcellen te genereren bollen of differentiëren naar neuron-achtige cellen. Olfactorische stamcellen kunnen worden gebruikt om i) te repareren hersenziekten of trauma of ii) identificeren van moleculaire merkers van het centrale zenuwstelsel ziekten. Illustraties zijn gemaakt met de hulp van Servier Medical Art. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Cultuur en differentiatie van nasale menselijke olfactorische stamcellen. Menselijke stamcellen uit de lamina propria explantatie (A) groeit snel delende, toen gecultiveerd in een serum-bevattend medium. Stamcellen express de stemness marker Nestin (B). Wanneer geplateerd op poly-L-lysine-gecoate kunststof en gekweekt in een serum-vrije cultuur medium aangevuld met EGF en FGF2, olfactorische stamcellen te genereren bollen (C). Sphere-afgeleide cellen, wanneer uitgeplaat in serum-bevattende kweekmedium, aanleiding geven tot GFAP expressie cellen (~ 50%), tubuline expressie cellen (~ 10-15%) en O4 expressie cellen (~ 2-5%) 9 (DF). Wanneer ze groeien in een Neurobasal kweekmedium aangevuld met B27 en glutamaat, ze differentiëren tot neuron-achtige cellen die β-III tubuline (G) en MAP2 (H).

<ol>
	<li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons.">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li><li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett's+syndrome.">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li><li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+adhesion,+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia.">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li><li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific,+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders.">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li><li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease.">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li><li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+stem+cells,+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia.">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li><li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses.">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li><li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+olfactory+stem+cells.">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa.">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li><li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa.">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li><li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties.">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li><li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery.">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li><li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss.">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li><li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice.">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia:+a+3-year+clinical+trial.">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De technieken die hier maken het knaagdier-en menselijke reuk slijmvlies een nuttig model voor klinisch onderzoek naar de oorzaken van neurologische en neurodegeneratieve ziekten en als een instrument voor het herstellen van de pathologische of getraumatiseerd hersenen. Het protocol is betrekkelijk eenvoudig en kan gemakkelijk worden uitgevoerd door een ervaren celbioloog. Het slagingspercentage voor de biopsie en de cultuur technieken is hoog. Kritische stappen <ul><li> Voor het verzamelen van knaagdieren olfactorische mucosa, wordt aanbevolen om geen tijdslimiet van 10 minuten tussen euthanasie en de uiteindelijke excisie van de olfactorische weefsel overschrijden. </li><li> De dissociatie van het knaagdieren olfactorische lamina propria wordt gewoonlijk bereikt na 10 minuten. incubatie in collagenase IA. Zo niet, dan raden wij u aan de dag verzamelen na de supernatant waarin ongedissocieerde stukjes van de lamina propria float, het centrifugeren bij 200 g en mechanisch dissociëren de drijvende lamina met behulp van een Pasteur pipet voor replating de cellen in een nieuwe put. De eerste goed met de reeds aan cellen is gevuld met vers kweekmedium. </li><li> Voor de menselijke lamina propria, wat meer is compacter dan de knaagdieren weefsel, raden we een enzymatische dissociatie. Het weefsel is gesneden en elk Explantatie wordt ingevoegd tussen de bodem van de plastic schotel en een glas dekglaasje aan. Succesvolle culturen zijn explantaten waarvan de dikte van 200 tot 500 pm. </li></ul> Eventuele wijzigingen <ul><li> Het huidige protocol kan enigszins worden gewijzigd om olfactorische neuronen in vitro te genereren. Voor dat doel is het neuro-epitheel niet verwijderd en het hele olfactorische mucosa is gesneden met een McIlwain chopper (200 micrometer dikte). Elke Explantatie is bedekt met een schotel, gedeeltelijk gedroogde gedurende een uur en daarna gerehydrateerd met FCS-bevattende kweekmedium. Tijdens de eerste dagen na de plating, epitheliale en mesenchymale cellen groeien uit de explantatie. Dan zal neuron voorouders migreren op de top van deze cel laag en differentiëren tot neuronen. </li><li> Zuivering van olfactorische stamcellen kunnen worden bereikt met behulp van flow cytometrie. Specifieke oppervlakte merkers kunnen worden opgehaald uit de lijst die is gepubliceerd in de karakterisering papier 11. </li><li> Voor de transplantatie-experimenten, is het mogelijk gebruik te maken van een stam van ratten, waarvan olfactorische stamcellen zijn GFP-positief. Deze rat stam (Sprague Dawley, eGFP gedreven door de PGK promoter) is beschikbaar op ITERT (Nantes, Frankrijk). Voor het invoegen van de GFP-gen in menselijke geur stamcellen maken wij gebruik van een methode gebaseerd op lentivirus infectie. </li><li> Dit document is gericht op olfactorische ecto-mesenchymale stamcellen. Kan echter een ander celtype van belang, de olfactorische ensheathing cellen, worden gezuiverd van hetzelfde weefsel. We beschreven een methode voor de afvoer en zuivering 1,17 en we menselijke neus ensheathing cellen die worden gebruikt voor een fase I / IIa klinische studie bij dwarslaesie patiënten van 18. </li><li> Als lid van de mesenchymale stamcellen superfamilie, OE-MSC&#39;s zijn in staat, onder de juiste kweekomstandigheden, om te differentiëren in adipocyten, osteocyten en myocyten 11. </li></ul> Toekomstige toepassingen <ul><li> We hebben al gebruikt de menselijke reuk biopten cellulaire en moleculaire afwijkingen bij patiënten met autisme, bipolaire stoornis, familiale dysautonomie, de ziekte van Parkinson, Alzheimer en schizofrenie 2-7 te bestuderen. Theoretisch kunnen alle hersenaandoeningen worden bestudeerd met behulp van nasale biopsies of perifere olfactorische stamcellen. </li><li> Knaagdier-en menselijke nasale olfactorische stamcellen zijn al geënt in diermodellen van geheugenverlies, de ziekte van Parkinson, cochleaire schade en het ruggenmerg trauma 12-16. Het is denkbaar om deze cellen te transplanteren in diermodellen van de ziekte van Alzheimer, de hersenen ischemie, Multiple sclerose. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td colspan="3"> Het verzamelen van olfactorische slijmvlies bij ratten </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Natriumpentobarbital </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 gauge naald </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Pincet </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Het verzamelen van olfactorische slijmvlies bij de mens </td></tr><tr><td> Rigide endoscoop </td><td> Karl Storz of Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaïne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epinefrine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut zeefbeen pincet </td><td> Karl Storz of Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Isolatie van olfactorische stamcellen </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micro spatel </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Glazen dekglaasje </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Sphere vorming en neuronale differentiatie </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> Insuline transferrine selenium (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Neurobasal medium </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 Serum-Free Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutamaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

De olfactorische mucosa, gelegen in de neusholte, is belast met het opsporen van geuren. Het is ook de enige zenuwweefsel dat is blootgesteld aan de externe omgeving en goed bereikbaar in elk levend individu. Als gevolg hiervan, dit weefsel is uniek voor iedereen gericht op moleculaire afwijkingen in de hersenen pathologische identificeren of volwassen stamcellen te isoleren voor celtherapie. Moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten zijn vaak bestudeerd met behulp van zenuwweefsel monsters verzameld post-mortem. Echter, dit materiaal heeft tal van beperkingen. In tegenstelling, de olfactorische slijmvlies is gemakkelijk toegankelijk en kan veilig worden gebiopteerd, zonder enig verlies van reukvermogen 1. Dienovereenkomstig, de olfactorische slijmvlies biedt een &quot;open venster&quot; in het volwassen menselijk waardoor men kan studeren ontwikkelingsstoornissen (bijv. autisme, schizofrenie), 2-4 of neurodegeneratieve (bijvoorbeeld Parkinson, Alzheimer) ziekten 4,5. Olfactorische mucosa kan worden gebruikt voor zowel vergelijkende moleculaire studies 4,6 of in vitro experimenten op neurogenese 3,7. Het reukepitheel is ook een zenuwweefsel dat nieuwe neuronen produceren elke dag te vervangen die beschadigd zijn door vervuiling, bacteriële van virale infecties. Deze permanente neurogenese wordt ondersteund door voorlopers, maar ook stamcellen die binnen beide compartimenten van het slijmvlies, namelijk de neuroepithelium en de onderliggende lamina propria 8-10. We hebben onlangs een methode ontwikkeld om de volwassen stamcellen zich in de lamina propria zuiveren en, nadat aangetoond dat ze nauw verbonden zijn met het beenmerg mesenchymale stamcellen (BM-MSC), noemden we ze olfactorische ecto-mesenchymale stamcellen (OE- MSC) 11. Interessant is dat in vergelijking met de BM-MSC&#39;s, OE-MSC&#39;s tonen een hoge proliferatie tarief, een verhoogde clonogenicity en een neiging om te differentiëren naar neurale cellen. We hebben voordeel van deze kenmerken studies gewijd aan de nieuwe kandidaat-genen in schizofrenie en de ziekte van Parkinson 4 onthullen uit te voeren. Wij en anderen hebben ook aangetoond dat de OE-MSC&#39;s in aanmerking komen voor celtherapie veelbelovend, na een ruggenmerg trauma 12,13, een cochleaire schade 14, of in een diermodellen van de ziekte van Parkinson 15 of 16 geheugenverlies. In deze studie presenteren we methoden om olfactorische slijmvlies biopsie bij ratten en mensen. Na het verzamelen, is de lamina propria enzymatisch gescheiden van het epitheel en de stamcellen worden gezuiverd met behulp van een enzymatische of een niet-enzymatische methode. Gezuiverde olfactorische stamcellen kunnen dan ofwel die in grote aantallen en opgeslagen in vloeibare stikstof of aangezet tot sferen vorm of gedifferentieerd in neurale cellen. Deze stamcellen kunnen ook worden gebruikt voor vergelijkende omica (genomische, transcriptoom, epigenomisch, proteoom) studies.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans at JoVE.com

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Elektrofysiologische metingen van een Moth olfactorisch systeem

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modeling Astrocytoom Pathogenese<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...