Name: isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00
Duration: 9 min 19 s
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Ce travail a été financièrement soutenu par l&#39;ANR (Agence Nationale de la Recherche), l&#39;AFM (Association Française contre les Myopathies ERP), le FEDER en PACA et IRME (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale). Nous tenons à remercier Marie-Pierre Blanchard (Institut Jean Roche) pour son aide efficace lors de l&#39;enregistrement laps de temps.

1. Collecte de muqueuse olfactive chez le rat <ol><li> Commencez par préparer trois boîtes de Pétri de 35 mm rempli de DMEM / HAM F12 milieu de culture dans une hotte de culture propre. </li><li> Toute méthode d&#39;euthanasie doit être approuvé au préalable par les soins des animaux de l&#39;institution et le comité et qui sont exécutés par du personnel qualifié. Après que le rat est entré dans une anesthésie profonde avec du pentobarbital sodique ou d&#39;autres formes injectables de l&#39;anesthésie comme la kétamine / xylazine, décapiter et enlever la peau. Anesthésiques inhalés doivent être évités. Adéquation d&#39;anesthésie seront évaluées par pincement de l&#39;orteil avant la décapitation. Retirez la mâchoire inférieure avec des ciseaux et avec l&#39;aide d&#39;un rongeur, d&#39;éliminer les muscles du visage des deux côtés. </li><li> A partir de la face postérieure des incisives, enlever avec une pince-gouge couvrant l&#39;os de la cavité nasale, d&#39;un côté à la fois. Les cornets olfactifs entreront en vue que l&#39;orange / marron organes situés à l&#39;arrière du nez. </li><li> Délicatement jeter les cornets avec une pince. En utilisant une aiguille de calibre 26, isoler la muqueuse olfactive couché sur le septum en coupant le tissu autour de trois axes: l&#39;arc de la lame perpendiculaire, la lame criblée et le plafond de la cavité nasale. </li><li> Recueillir des biopsies sur les deux côtés et de les transférer dans un milieu DMEM / HAM F12-remplie boîte de Pétri. Cette procédure ne devrait pas prendre plus de temps de 10 minutes de l&#39;euthanasie apparition. </li><li> Maintenant, afin d&#39;éliminer le mucus, le transfert des biopsies deux fois en boîte de Pétri moyen remplis. </li></ol> 2. Collecte de muqueuse olfactive chez l&#39;homme <ol><li> Cette procédure doit être effectuée par un oto-rhino-laryngologie (ORL), conformément aux dispositions pertinentes d&#39;éthique local du comité (s), et tous les soins ambulatoires devrait signer un formulaire de consentement éclairé. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un 0 ° ou 30 ° endoscope rigide (4 mm de diamètre), inspecter les cavités nasales et d&#39;évaluer la présence supposée de polypes ou de toute lésion inflammatoire. Choisissez le meilleur cavité nasale, en tenant compte de la déviation de la cloison. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un applicateur en coton, appliquer un anesthésique local, comme la lidocaïne avec épinéphrine, pendant 10 minutes. </li><li> Avec une pince throughcut ethmoïde, de recueillir deux millimètre carré de biopsie soit à la racine de la face médiale du cornet moyen ou sur le septum dans la zone dorsomédial. </li><li> La biopsie du olfactive est ensuite transféré, à l&#39;aide d&#39;une aiguille stérile, dans une stérile 2 ml tube rempli de 1 ml de DMEM / HAM F12. Astuce le tube à l&#39;envers pour faire en sorte que la biopsie est immergé dans le milieu de culture. </li><li> Insérez le tube dans un conteneur réfrigéré et le transport au laboratoire de recherche. A ce stade, la biopsie peut être utilisée en soi pour les études comparatives sur les maladies moléculaires spécifiques du cerveau ou traitées pour générer des cellules souches. </li></ol> 3. Isolement de cellules souches humaines et olfactive du rat Muqueuse <ol><li> Lavez les biopsies dans du DMEM / HAM F12. Incuber les biopsies dans une boîte de Pétri remplie de 1 ml de solution de dispase II (2,4 UI / ml), pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Ensuite, sous un microscope à dissection avec une lumière diffractée inversée, l&#39;épithélium olfactif est retiré de la lamina propria sous-jacente à l&#39;aide d&#39;une spatule micro. </li><li> L&#39;épithélium olfactif est plus mince et regarde translucide sur un fond noir par rapport à la lamina propria qui est rayé orange / marron. Sur un fond blanc, l&#39;épithélium est gris et la lamina propria, marron. </li><li> Une fois purifié, le transfert de la lamina propria dans une boîte de Pétri remplie de DMEM / HAM F12. </li><li> Si le tissu provient d&#39;un rongeur, puis couper la lamina propria en petits morceaux avec deux aiguilles de calibre 25. Ensuite, transférez les morceaux d&#39;un tube de 15 ml remplie de 1 ml de collagénase IA. </li><li> Dans le tube, en utilisant une pipette en plastique stérile, dissocient le tissu. Puis, incuber le tube pendant 10 minutes à 37 ° C. </li><li> Pour mettre fin à la dissociation, secouez légèrement le tube et ajouter 9 ml de Ca et Mg-libres sans PBS et centrifuger à 200 g pendant 5 minutes. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans du DMEM / HAM F12 milieu de culture supplémenté en sérum de veau foetal à 10%, les antibiotiques et la plaque sur des boîtes de culture en plastique. </li><li> Maintenant, si le tissu est humain, puis coupez la lamina propria en 3 à 4 pièces avec une épaisseur allant de 200 à 500 um. </li><li> Insérez chaque bande dans sa propre boîte de culture 2 cm de diamètre et de couvrir le tissu avec stériles 1,3 cm glisse diamètre couvercle en verre. </li><li> Ensuite, ajouter 500 ul de milieu de culture (DMEM / HAM F12 complété avec du sérum de veau foetal à 10% et des antibiotiques) pour chaque boîte de culture. </li><li> Pour chaque type de tissu, de renouveler le milieu de culture tous les 2 à 3 jours. </li><li> Cinq à sept jours après, les cellules souches vont commencer à envahir la boîte de culture et après deux semaines, ils doivent être confluentes. Lorsque la confluence est atteinte, le passage et le transfert aux cellules de flacons de culture. </li></ol> 4. Formation Sphère et Différé neuronalentiation des cellules souches olfactive <ol><li> Pour générer les sphères de cellules souches, incuber les flacons pendant deux heures à 37 ° C avec de la poly-L-lysine. (TEXTE: 5 g/cm2). </li><li> Assiette des cellules à une densité de 16.000 cellules par centimètre carré dans les flacons traités. </li><li> Tous les deux jours, nourrir les cellules avec 0,2 ml par centimètre carré de milieu supplémenté (DMEM / HAM F12 complété avec de l&#39;insuline, la transferrine, sélénium (SES-X, 1%), l&#39;EGF (50 ng / ml) et FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> Deux à cinq jours plus tard, de collecter les sphères de cellules flottantes et soit re-plaque ou les dissocier avant la greffe dans des modèles animaux de la thérapie cellulaire. </li><li> Pour différencier les cellules souches olfactives dans les neurones comme des cellules, les cultiver pendant 21 jours dans un milieu contenant Neurobasal B-27, la pénicilline, la streptomycine, la glutamine et le glutamate. </li><li> Puis faire des changements moyenne tous les 3 jours. Neuron-comme des cellules devrait apparaître au bout de deux à trois semaines. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Nasale humaine explant-l&#39;étroit cellules souches (figure 2A) sont divisant rapidement et de confluence peut être atteint en une à deux semaines. Une caractéristique clé du caractère souche, expression de la nestine, a été évaluée (figure 2B). Lorsqu&#39;il est cultivé sur des poly-L-lysine avec un milieu de culture sans sérum complété par l&#39;EGF (50 ng / ml) et FGF2 (50 ng / ml), les cellules souches olfactives donnent lieu à des sphères (figure 2C). Lorsqu&#39;il est cultivé dans le milieu de culture contenant du sérum nouvellement sphères plaquées donner lieu à des cellules exprimant la GFAP-(~ 50%), les cellules exprimant la tubuline (~ 10-15%) et O4 cellules exprimant (~ 2-5%) 9 (figures 2D-F). Cependant, le sort de la sphère de cellules dérivées peuvent être modifiés. Par exemple, lorsqu&#39;elles sont cultivées dans un milieu de culture Neurobasal complétée par B27 et le glutamate, la plupart des cellules souches olfactives nasales en neurones, comme les cellules exprimant la tubuline β-III (figure 2G) et MAP2 (figure 2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Diagramme d&#39;ensemble de l&#39;expérience. Olfactive des biopsies muqueuses sont excisés de rat ou humains cavité nasale. Explants peut être utilisé en soi pour les études comparatives moléculaires visant à identifier des biomarqueurs dans les maladies du cerveau. Pour isoler des cellules souches olfactives, les interactions entre la lamina propria et le neuro-épithélium sont perturbés avec l&#39;enzyme dispase II et, après 45 minutes, l&#39;épithélium est enlevé avec une spatule de micro-. Cellules souches olfactives rongeurs sont davantage sélectionnés en dissociant la lamina propria par la collagénase IA. Pour les tissus humains, des morceaux de la lamina propria olfactifs sont cultivées dans la lamelle de verre jusqu&#39;à l&#39;étroit envahissent les cellules souches dans l&#39;ensemble bien. Après la prolifération, en utilisant un milieu de culture approprié, les cellules souches olfactives peuvent générer des sphères ou se différencier en neurones comme des cellules. Les cellules souches olfactives peuvent être utilisés pour i) les maladies du cerveau de réparation ou d&#39;un traumatisme ou ii) identifier des marqueurs moléculaires de maladies du système nerveux central. Les illustrations sont faites avec l&#39;aide de Servier Medical Art. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Culture et de la différenciation des cellules souches humaines nasales olfactif. Les cellules souches humaines de plus en plus hors de la lamina propria explant (A) sont divisant rapidement, lorsqu&#39;elles sont cultivées dans un milieu contenant du sérum. Les cellules souches expriment le marqueur de caractère souche nestine (B). Lorsque plaqué sur la poly-L-lysine en plastique et cultivées dans un milieu de culture sans sérum complété par l&#39;EGF et FGF2, les cellules souches olfactives générer des sphères (C). Sphère des cellules dérivées, quand plaqués en milieu de culture contenant du sérum, donner lieu à des cellules exprimant la GFAP-(~ 50%), les cellules exprimant la tubuline (~ 10-15%) et O4 cellules exprimant (~ 2-5%) 9 (DF). Lorsqu&#39;il est cultivé dans un milieu de culture Neurobasal complétée par B27 et le glutamate, ils se différencient en neurones, comme les cellules exprimant la tubuline β-III (G) et MAP2 (H).

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les techniques présentées ici font le rongeur et humaine muqueuse olfactive un modèle utile pour la recherche clinique sur les causes des maladies neurologiques et neurodégénératives ainsi que d&#39;un outil pour réparer le cerveau pathologique ou traumatisés. Le protocole est relativement simple et peut être facilement réalisée par un biologiste cellulaire expérimentés. Le taux de réussite pour les techniques de biopsie et de la culture est élevé. Les étapes critiques <ul><li> Pour la collecte de la muqueuse olfactive chez les rongeurs, il est recommandé de ne pas dépasser un délai de 10 minutes entre l&#39;euthanasie et l&#39;excision finale du tissu olfactif. </li><li> La dissociation de la lamina propria rongeurs olfactive est habituellement obtenue après 10 min. incubation dans la collagénase IA. Sinon, nous vous recommandons de rassembler le lendemain du surnageant dans lequel les bits non dissocié du flottant de la lamina propria, il centrifuger à 200 g et mécaniquement dissocier la lamina flottante à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur, avant replating les cellules dans un nouveau puits. Le premier puits contenant les cellules déjà fixé est rempli de milieu de culture frais. </li><li> Pour la lamina propria humain, qui est plus compact que le tissu des rongeurs, nous ne recommandons pas une dissociation enzymatique. Le tissu est coupé en tranches et chaque explant est inséré entre le fond du plat en plastique et une lamelle de verre. Cultures réussies comprennent explants dont l&#39;épaisseur allant de 200 à 500 um. </li></ul> D&#39;éventuelles modifications <ul><li> Le protocole actuel peut être légèrement modifiée afin de générer des neurones olfactifs in vitro. À cette fin, le neuro-épithélium n&#39;est pas supprimé et la muqueuse olfactive est toute en tranches avec un hacheur McIlwain (200 um d&#39;épaisseur). Chaque explant est plaqué dans un plat, partiellement séché pendant une heure et ensuite réhydraté avec un milieu de culture contenant du FCS. Pendant le placage après les premiers jours, les cellules épithéliales et mésenchymateuses se développer hors de l&#39;explant. Ensuite, les progéniteurs des neurones vont migrer sur le dessus de cette couche de cellules et de se différencier en neurones. </li><li> Purification des cellules souches olfactives peuvent être obtenus en utilisant la cytométrie de flux. Marqueurs de surface spécifiques peuvent être extraites de la liste publiée dans le journal 11 de caractérisation. </li><li> Pour les expériences de transplantation, il est possible d&#39;utiliser une souche de rats dont les cellules olfactives souches sont GFP-positives. Cette souche de rat (Sprague-Dawley, eGFP entraîné par le promoteur PGK) est disponible à ITERT (Nantes, France). Pour l&#39;insertion du gène GFP dans les cellules souches olfactives, nous utilisons une méthode basée sur l&#39;infection des lentivirus. </li><li> Ce document est axé sur les cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses. Cependant, un autre type cellulaire d&#39;intérêt, les cellules olfactives engainantes, peut être purifiée à partir du même tissu. Nous avons décrit une méthode pour leur collecte et l&#39;épuration 1,17 et nous avons utilisé des cellules engainantes nasales humaines pour une phase I / IIa d&#39;essais cliniques chez des patients paraplégiques 18. </li><li> En tant que membre de la superfamille des cellules souches mésenchymateuses, OE-MSC sont capables, dans des conditions de culture approprié, de se différencier en adipocytes, ostéocytes et les myocytes 11. </li></ul> Les applications futures <ul><li> Nous avons déjà utilisé des biopsies humaines olfactifs pour étudier les anomalies cellulaires et moléculaires chez les patients souffrant d&#39;autisme, le trouble bipolaire, la dysautonomie familiale, la maladie de Parkinson, maladie d&#39;Alzheimer et la schizophrénie 2-7. Théoriquement, toutes les maladies du cerveau peut être étudiée en utilisant des biopsies nasales ou de cellules souches périphériques olfactif. </li><li> Rongeurs et les cellules souches humaines nasales olfactifs ont déjà été greffées dans des modèles animaux de l&#39;amnésie, la maladie de Parkinson, lésions cochléaires et les traumatismes de la moelle épinière 12-16. Il est concevable de transplanter ces cellules dans des modèles animaux de la maladie d&#39;Alzheimer, l&#39;ischémie cérébrale, sclérose en plaques. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td colspan="3"> Collection de la muqueuse olfactive chez les rats </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital sodique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> TSF </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille de calibre 26 </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Forceps </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Collection de la muqueuse olfactive chez l&#39;homme </td></tr><tr><td> Endoscope rigide </td><td> Karl Storz ou Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td> La lidocaïne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;épinéphrine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut ethmoïde pince </td><td> Karl Storz ou Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> L&#39;isolement des cellules souches olfactives </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micro spatule en </td><td> TSF </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Verre lamelle </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Formation de Sphère et la différenciation neuronale </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> L&#39;insuline transferrine sélénium (SES) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Milieu Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 sans sérum Supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Le glutamate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

La muqueuse olfactive, située dans la cavité nasale, est en charge de détecter les odeurs. Il est également le seul tissu nerveux qui est exposée à l&#39;environnement extérieur et facilement accessible à chaque individu vivant. En conséquence, ce tissu est unique pour quiconque vise à identifier les anomalies moléculaires dans le cerveau pathologique ou isoler les cellules souches adultes pour la thérapie cellulaire. Les anomalies moléculaires dans les maladies du cerveau sont souvent étudiés en utilisant des échantillons de tissus nerveux prélevés post-mortem. Toutefois, ce matériau a de nombreuses limites. En revanche, la muqueuse olfactive est facilement accessible et peut être biopsiées en toute sécurité sans aucune perte de l&#39;odorat 1. Par conséquent, la muqueuse olfactive offre une «fenêtre ouverte» dans l&#39;homme adulte à travers lequel on peut étudier le développement (par exemple l&#39;autisme, la schizophrénie) 2-4 ou neurodégénératives (par exemple Parkinson, Alzheimer) 4,5 maladies. Muqueuse olfactive peut être utilisé soit pour les études comparatives moléculaires 4,6 ou dans des expériences in vitro sur la neurogenèse 3,7. L&#39;épithélium olfactif est aussi un tissu nerveux qui produit de nouveaux neurones par jour pour remplacer ceux qui sont endommagés par la pollution, bactéries des infections virales. Cette neurogenèse permanente est soutenue par les progéniteurs, mais aussi des cellules souches résidant dans les deux compartiments de la muqueuse, à savoir le neuroépithélium et les sous-tendent lamina propria 80-10. Nous avons récemment développé une méthode pour purifier les cellules souches adultes situées dans la lamina propria et, après avoir démontré qu&#39;ils sont étroitement liés aux cellules de la moelle osseuse souches mésenchymateuses (CSM-BM), nous avons nommé les cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses (OE- MSC) 11. Fait intéressant, lorsque comparé à BM-MSC, OE-MSC afficher un taux de prolifération élevé, une clonogénicité élevée et une inclination à se différencier en cellules neurales. Nous avons profité de ces caractéristiques pour réaliser des études dédiées à dévoiler de nouveaux gènes candidats dans la schizophrénie et la maladie de Parkinson 4. Nous et les autres ont aussi montré que OE-MSC sont des candidats prometteurs pour la thérapie cellulaire, après un traumatisme de la moelle épinière 12,13, un dommage cochléaire 14 ou dans un modèle animal de maladie de Parkinson ou d&#39;amnésie 15 16. Dans cette étude, nous présentons les méthodes pour la biopsie muqueuse olfactive chez les rats et les humains. Après la collecte, la lamina propria est enzymatiquement séparés de l&#39;épithélium et les cellules souches sont purifiés en utilisant une méthode enzymatique ou non enzymatique. Purifié cellules souches olfactives peuvent alors être soit cultivées en grand nombre et mis en banque dans l&#39;azote liquide ou induite pour former des sphères ou différenciées en cellules neurales. Ces cellules souches peuvent aussi être utilisés pour omique comparatif (génomique, transcriptomique, épigénomique, protéomique) des études.

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Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Nous décrivons ici une méthode pour biopsies muqueuse olfactive de rat et humain des cavités nasales. Ces biopsies peuvent être utilisés soit pour identifier les anomalies moléculaires dans les maladies du cerveau ou d&#39;isoler cellules souches adultes multipotentes qui peuvent être utilisés pour la transplantation de cellules dans des modèles animaux de traumatisme crânien / maladie

Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Mesures électrophysiologiques à partir d&#39;un système de Moth olfactive

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Recherche

Neurosciences

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modélisation astrocytome pathogenèse<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurones olfactifs obtenus à l&#39;aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...