Name: isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00
Duration: 9 min 19 s
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यह काम आर्थिक ANR (Agence Nationale डे ला Recherche) AFM (एसोसिएशन Française contre les myopathies), PACA और IRME में Feder (Institut डी Recherche सुर ला Moelle épinière एट Encéphale l&#39;) द्वारा समर्थित किया गया. हम कृतज्ञता मैरी पियरे Blanchard (जीन रॉश संस्थान) को समय चूक रिकॉर्डिंग के दौरान उसे कुशल मदद के लिए धन्यवाद.

1. चूहे में घ्राण mucosa का संग्रह <ol><li> तीन 35 मिमी पेट्री / DMEM हैम F12 एक साफ संस्कृति हुड में संस्कृति के माध्यम से भरा व्यंजन की तैयारी द्वारा शुरू करो. </li><li> इच्छामृत्यु की कोई विधि अग्रिम में संस्था जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए और योग्य कर्मियों द्वारा बाहर किए गए. बाद चूहे सोडियम / ketamine xylazine जैसे संज्ञाहरण के pentobarbital या अन्य इंजेक्शन रूपों के साथ गहरे संज्ञाहरण में प्रवेश किया है, सिर काटना, और त्वचा को हटा दें. Inhalant anesthetics बचा जाना चाहिए. संज्ञाहरण की पर्याप्तता पैर के अंगूठे चुटकी से मूल्यांकन किया जाएगा कत्ल करने के लिए पहले. कैंची के साथ निचले जबड़े निकालें और एक rongeur की मदद के साथ, दोनों पक्षों पर चेहरे की मांसपेशियों को समाप्त. </li><li> Incisors के पीछे से शुरू है, एक rongeur नाक गुहा, एक समय में एक पक्ष को कवर हड्डी के साथ हटा दें. घ्राण turbinates दृष्टि में आने के रूप में अंगों / नारंगी भूरे रंग के नाक के पीछे में स्थित है. </li><li> नाजुक एक संदंश के साथ turbinates त्यागें. सीधा प्लेट, cribriform थाली और नाक गुहा की छत की चाप: एक 26 गेज सुई का प्रयोग, घ्राण तीन लाइनों के साथ ऊतक काटने से पट पर झूठ बोल mucosa अलग. </li><li> दोनों पक्षों पर बायोप्सी लीजिए और DMEM / हैम F12 भरा पेट्री डिश में उन्हें हस्तांतरण. यह प्रक्रिया अब शुरुआत इच्छामृत्यु से 10 मिनट से अधिक नहीं लेना चाहिए. </li><li> अब, क्रम में बलगम निकालने के के लिए, मध्यम भरे पेट्री डिश में दो बार बायोप्सी हस्तांतरण. </li></ol> 2. घ्राण mucosa के मानव में संग्रह <ol><li> यह प्रक्रिया एक कान, नाक और गला (ईएनटी) सर्जन के द्वारा किया जाना चाहिए प्रासंगिक स्थानीय नैतिक समिति (ओं) के अनुसार, और हर आउट पेशेंट एक सूचित सहमति फार्म पर हस्ताक्षर करना चाहिए. </li><li> 0 ° या 30 ° कठोर endoscope के (4 मिमी व्यास) का उपयोग करना, दोनों नाक cavities के निरीक्षण और जंतु या किसी भी भड़काऊ घाव के ख्यात उपस्थिति का आकलन. चुनें सबसे अच्छा नाक गुहा, खाते में पट के विचलन ले. </li><li> एक कपास applicator का प्रयोग, एपिनेफ्रीन के साथ 10 मिनट के लिए एक स्थानीय चतनाशून्य करनेवाली औषधि lidocaine के रूप में लागू है. </li><li> Throughcut सलाखें संदंश के साथ, एक दो वर्ग मिलीमीटर बायोप्सी या तो इकट्ठा मध्यम turbinate की औसत दर्जे का पहलू की जड़ में या dorsomedial क्षेत्र में पट पर. </li><li> घ्राण बायोप्सी तो, स्थानांतरित कर रहा है एक बाँझ सुई का उपयोग कर एक बाँझ 2 मिलीलीटर DMEM / हैम F12 1 मिलीलीटर के साथ भर ट्यूब में. ट्यूब उल्टा नीचे टिप को यकीन है कि बायोप्सी मध्यम संस्कृति में डूब जाता है. </li><li> ट्यूब को एक प्रशीतित कंटेनर में डालें और यह अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए परिवहन. इस स्तर पर, बायोप्सी से प्रति तुलनात्मक आणविक विशिष्ट मस्तिष्क रोगों पर ध्यान केंद्रित या स्टेम सेल पैदा करने के लिए कार्रवाई के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकते हैं. </li></ol> 3. मानव और चूहा mucosa से घ्राण स्टेम सेल के अलगाव <ol><li> DMEM / हैम F12 में बायोप्सी धो लें. Dispase द्वितीय समाधान (2.4 आइयू / एमएल) का 1 मिलीलीटर के साथ भरा एक पेट्री डिश में बायोप्सी सेते हैं, 37 पर 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस </li><li> अगले, एक diffracted औंधा प्रकाश के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत, घ्राण उपकला अंतर्निहित लामिना propria से एक सूक्ष्म रंग का उपयोग कर निकाल दिया जाता है. </li><li> घ्राण उपकला पतली है और लामिना propria जो धारीदार है की तुलना में एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर पारदर्शी लगता है / नारंगी भूरे रंग के. एक सफेद पृष्ठभूमि पर ग्रे उपकला और लामिना propria, भूरे रंग दिखता है. </li><li> एक बार शुद्ध, DMEM / हैम F12 के साथ भरा एक पेट्री डिश में लामिना propria हस्तांतरण. </li><li> अगर ऊतक एक कृंतक से है, तो छोटे - छोटे टुकड़ों में दो 25 गेज सुई के साथ लामिना propria में कटौती. फिर, एक 15 मिलीलीटर collagenase आइए के 1 मिलीलीटर से भरा ट्यूब के टुकड़े हस्तांतरण. </li><li> ट्यूब में, एक बाँझ प्लास्टिक विंदुक का उपयोग, ऊतक अलग कर देना. फिर, 10 मिनट के लिए 37 ट्यूब सेते डिग्री सेल्सियस </li><li> हदबंदी को समाप्त करने के लिए, धीरे ट्यूब रॉक और Ca मुक्त और मिलीग्राम मुक्त पीबीएस के 9 मिलीग्राम और 5 मिनट के लिए 200 ग्राम पर अपकेंद्रित्र जोड़ें. </li><li> सेल गोली Resuspend / DMEM हैम F12 संस्कृति 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, एंटीबायोटिक दवाओं और प्लास्टिक की संस्कृति बर्तन पर थाली के साथ पूरक मध्यम में. </li><li> अब, अगर ऊतक मानव है, तो 200 से 500 सुक्ष्ममापी से लेकर एक मोटाई के साथ 3 से 4 टुकड़ों में लामिना propria टुकड़ा. </li><li> अपने स्वयं के 2 सेमी व्यास संस्कृति पकवान में प्रत्येक पट्टी सम्मिलित करें, और बाँझ 1.3 सेमी व्यास का गिलास को कवर फिसल जाता है के साथ ऊतक कवर. </li><li> फिर, प्रत्येक संस्कृति डिश के लिए संस्कृति के माध्यम से 500 μl (DMEM / हैम F12 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक) जोड़ने. </li><li> या तो ऊतक प्रकार के लिए हर 2 से 3 दिनों संस्कृति के माध्यम नवीनीकृत. </li><li> पांच से सात दिनों के बाद, स्टेम सेल संस्कृति डिश आक्रमण शुरू और दो सप्ताह के बाद वे मिला हुआ होना चाहिए. मार्ग है, जब confluency तक पहुँच जाता है और संस्कृति बोतल के लिए कोशिकाओं हस्तांतरण. </li></ol> 4. क्षेत्रः संरचना और Neuronal Differeघ्राण स्टेम सेल के ntiation <ol><li> स्टेम सेल क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए, 37 पर दो घंटे के लिए बोतल सेते ° सी पाली एल lysine साथ. (पाठ: 5 g/cm2). </li><li> बोतल में इलाज वर्ग सेंटीमीटर प्रति 16,000 कोशिकाओं के घनत्व प्लेट में कोशिकाओं. </li><li> हर दो दिन, 0.2ml (DMEM / हैम F12 इंसुलिन, transferrin, सेलेनियम (इसके एक्स, 1%), (50 एनजी / एमएल) EGF और (FGF2 के साथ पूरक पूरक मध्यम वर्ग सेंटीमीटर प्रति के साथ कोशिकाओं फ़ीड 50 एनजी / ) मिलीलीटर). </li><li> दो से पांच दिनों के बाद, अस्थायी सेल क्षेत्रों और या तो फिर से थाली इकट्ठा या सेल थेरेपी के पशु मॉडल में कलम बांधने का काम पहले उन्हें अलग कर देना. </li><li> न्यूरॉन की तरह कोशिकाओं में घ्राण स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए, उन्हें Neurobasal माध्यम से 21 दिनों बी 27, पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन glutamine, और ग्लूटामेट युक्त करने के लिए खेती. </li><li> फिर हर 3 दिनों मध्यम परिवर्तन कर. न्यूरॉन कोशिकाओं की तरह दो से तीन सप्ताह के बाद दिखाई देनी चाहिए. </li></ol> 5. प्रतिनिधि परिणाम: नाक मानव explant outgrowing स्टेम कोशिकाओं (चित्रा 2A) तेजी से विभाजित कर रहे हैं और एक से दो सप्ताह के भीतर confluency पहुँचा जा सकता है है. Stemness की एक प्रमुख विशेषता, nestin अभिव्यक्ति, (चित्रा 2B) मूल्यांकन किया गया था. जब एक सीरम मुक्त संस्कृति (50 एनजी / एमएल) EGF और FGF2 (50 एनजी / एमएल) के साथ पूरक मध्यम के साथ पाली एल lysine पर हो, घ्राण स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों (आंकड़ा 2C) को जन्म दे. जब सीरम युक्त संस्कृति के माध्यम में हो नव मढ़वाया क्षेत्रों GFAP-व्यक्त कोशिकाओं (~ 50%), ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं (~ 10-15%) और O4 व्यक्त कोशिकाओं (~ 2-5%) (9 आंकड़े को जन्म दे 2 डी एफ). हालांकि, क्षेत्र व्युत्पन्न कोशिकाओं के भाग्य को संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जब Neurobasal संस्कृति B27 और ग्लूटामेट, नाक न्यूरॉन की तरह β-III (चित्रा 2 जी) ट्यूबिलिन और MAP2 (चित्रा 2H) व्यक्त की कोशिकाओं में घ्राण स्टेम कोशिकाओं के अधिकांश के साथ पूरक मध्यम में हो. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="चित्रा 1"/> चित्रा 1 प्रयोग के समग्र योजना. घ्राण mucosa बायोप्सी चूहे या मानव नाक गुहा से excised हैं. Explants से प्रति तुलनात्मक आणविक मस्तिष्क रोगों में biomarkers की पहचान करने के लिए लक्ष्य के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. घ्राण स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए, लामिना propria के बीच बातचीत और न्यूरो उपकला dispase द्वितीय एंजाइम के साथ बाधित कर रहे हैं और 45 मिनट के बाद उपकला एक सूक्ष्म रंग के साथ हटा दिया जाता है. कृंतक घ्राण स्टेम कोशिकाओं आगे collagenase आइए साथ लामिना propria अलग द्वारा चयनित हैं. मानव ऊतक के लिए, घ्राण लामिना propria के टुकड़े कांच coverslip के तहत सुसंस्कृत हैं जब तक outgrowing स्टेम कोशिकाओं पूरी अच्छी तरह से आक्रमण. प्रसार के बाद, एक उपयुक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग करते हुए, घ्राण स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों उत्पन्न या न्यूरॉन की तरह कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं. घ्राण स्टेम कोशिकाओं मैं इस्तेमाल किया जा सकता है) की मरम्मत मस्तिष्क रोगों या आघात या ii) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों के आणविक मार्कर की पहचान. रेखांकन Servier मेडिकल कला की मदद के साथ बना रहे हैं. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="चित्रा 2"/> चित्रा 2 संस्कृति और नाक मानव घ्राण स्टेम कोशिकाओं की भिन्नता. मानव स्टेम कोशिकाओं लामिना propria explant (ए) के बाहर से बढ़ तेजी से विभाजित कर रहे हैं, जब एक सीरम युक्त मध्यम में खेती. स्टेम सेल stemness मार्कर nestin (बी) व्यक्त करते हैं. जब पाली एल lysine-लेपित प्लास्टिक पर चढ़ाया और सीरम मुक्त EGF और FGF2 के साथ पूरक एक संस्कृति माध्यम में खेती, घ्राण स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों (सी) को उत्पन्न करते हैं. क्षेत्रः व्युत्पन्न कोशिकाओं, जब सीरम युक्त संस्कृति के माध्यम में चढ़ाया, जन्म दे करने के लिए GFAP व्यक्त कोशिकाओं (~ 50%), ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं (~ 10-15%) और O4 व्यक्त कोशिकाओं (~ 2-5%) 9 (लोमो). जब Neurobasal संस्कृति B27 और ग्लूटामेट के साथ पूरक मध्यम में हो, वे न्यूरॉन की तरह β-III (G) ट्यूबिलिन और MAP2 (एच) व्यक्त की कोशिकाओं में अंतर है.

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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

तकनीक यहाँ प्रस्तुत कृंतक और neurodevelopmental और neurodegenerative रोगों के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोग या मस्तिष्क आघात की मरम्मत के लिए एक उपकरण के कारणों में मानव घ्राण mucosa नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाने. प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है और आसानी से एक अनुभवी सेल जीवविज्ञानी द्वारा किया जा सकता है बाहर ले. बायोप्सी और संस्कृति तकनीक के लिए सफलता की दर अधिक है. महत्वपूर्ण कदम <ul><li> कृंतक घ्राण mucosa के संग्रह के लिए, यह इच्छामृत्यु और घ्राण ऊतक के अंतिम छांटना के बीच 10 मिनट की एक समय सीमा से अधिक नहीं करने के लिए सिफारिश की है. </li><li> कृंतक घ्राण लामिना propria के पृथक्करण आमतौर पर 10 मिनट के बाद हासिल की है. collagenase आइए में ऊष्मायन. यदि नहीं, तो हम सतह पर तैरनेवाला लामिना propria नाव के undissociated टुकड़े, जिसमें यह 200 ग्राम में अपकेंद्रित्र और यंत्रवत् अलग कर देना अस्थायी लामिना का उपयोग कर एक अच्छी तरह से नई कोशिकाओं replating से पहले एक पाश्चर विंदुक के बाद दिन इकट्ठा करने की सलाह देते हैं. पहले अच्छी तरह से पहले से ही जुड़ी कोशिकाओं से युक्त ताजा संस्कृति के माध्यम से भरा है. </li><li> मानव लामिना propria, जो कृंतक ऊतकों की तुलना में और अधिक कॉम्पैक्ट है के लिए, हम एक enzymatic पृथक्करण सिफारिश नहीं है. ऊतक कटा हुआ है और प्रत्येक explant प्लास्टिक पकवान के नीचे और एक गिलास coverslip के बीच डाला जाता है. सफल संस्कृतियों explants जिनकी मोटाई रेंज 200 से 500 सुक्ष्ममापी तक शामिल हैं. </li></ul> संभावित संशोधनों <ul><li> वर्तमान प्रोटोकॉल थोड़ा क्रम में इन विट्रो में घ्राण न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए संशोधित कर सकते हैं. उस प्रयोजन के लिए, न्यूरो उपकला और हटाया नहीं पूरे घ्राण mucosa की एक McIlwain हेलिकॉप्टर (200 सुक्ष्ममापी मोटाई) के साथ कटा हुआ है. प्रत्येक explant एक डिश में चढ़ाया हुआ है, आंशिक रूप से एक घंटे के लिए सूखे और फिर FCS युक्त मध्यम संस्कृति के साथ rehydrated है. पहले दिन पोस्ट चढ़ाना के दौरान उपकला और mesenchymal कोशिकाओं explant से बाहर हो जाना. फिर, न्यूरॉन progenitors इस सेल परत के शीर्ष पर विस्थापित और न्यूरॉन्स में अंतर होगा. </li><li> घ्राण स्टेम कोशिकाओं के शोधन प्रवाह cytometry का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है. विशिष्ट सतह मार्करों लक्षण वर्णन कागज 11 में प्रकाशित की गई सूची में से लिया जा सकता है है. </li><li> प्रत्यारोपण के प्रयोगों के लिए, यह चूहों जिसका घ्राण स्टेम सेल GFP पॉजिटिव के एक तनाव का उपयोग करने के लिए संभव है. यह चूहा तनाव (Sprague Dawley, EGFP PGK प्रमोटर द्वारा संचालित) ITERT (नेंट्स, फ्रांस) पर उपलब्ध है. GFP मानव घ्राण स्टेम कोशिकाओं में जीन डालने के लिए, हम एक lentivirus संक्रमण के आधार पर विधि का उपयोग करें. </li><li> इस कागज घ्राण ecto mesenchymal स्टेम सेल पर केंद्रित है. हालांकि, ब्याज, घ्राण ensheathing कोशिकाओं, का एक और सेल प्रकार एक ही ऊतकों से शुद्ध किया जा सकता है. हम उनके संग्रह और 1,17 शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन है और हम एक चरण मैं / IIa paraplegic 18 रोगियों में चिकित्सीय परीक्षण के लिए मानव नाक ensheathing कोशिकाओं का इस्तेमाल किया. </li><li> Mesenchymal स्टेम सेल superfamily के एक सदस्य के रूप में, ँ MSCs कर रहे हैं, उचित संस्कृति की शर्तों के तहत, adipocytes osteocytes, और 11 myocytes में अंतर है. </li></ul> भविष्य अनुप्रयोगों <ul><li> हम पहले से ही मानव घ्राण बायोप्सी आत्मकेंद्रित, द्विध्रुवी विकार, पारिवारिक दुःस्वायत्तता, पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग और 2-7 एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों में सेलुलर और आणविक विसंगतियों के अध्ययन का इस्तेमाल किया है. सिद्धांततः, सभी मस्तिष्क रोगों नाक बायोप्सी या परिधीय घ्राण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है. </li><li> कृंतक और मानव नाक घ्राण स्टेम कोशिकाओं को पहले से ही भूलने की बीमारी, पार्किंसंस रोग, cochlear नुकसान और रीढ़ की हड्डी 12-16 आघात के पशु मॉडल में grafted किया गया है. यह अल्जाइमर रोग, मस्तिष्क ischemia, एकाधिक काठिन्य के पशु मॉडल में इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए बोधगम्य है. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td></tr><tr><td colspan="3"> चूहों में घ्राण mucosa का संग्रह </td></tr><tr><td> DMEM / हैम F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital सोडियम </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 गेज सुई </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> चिमटा </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> घ्राण mucosa की मनुष्यों में संग्रह </td></tr><tr><td> ठोस endoscope का </td><td> कार्ल Storz या रिचर्ड वुल्फ चिकित्सा </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> एपिनेफ्रीन </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut सलाखें संदंश </td><td> कार्ल Storz या रिचर्ड वुल्फ चिकित्सा </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> घ्राण स्टेम कोशिकाओं के अलगाव </td></tr><tr><td> Dispase द्वितीय </td><td> रॉश </td><td> 10 825 001 295 </td></tr><tr><td> विदारक माइक्रोस्कोप </td><td></td><td></td></tr><tr><td> माइक्रो रंग </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase आइए </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free पीबीएस </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> भ्रूण बछड़ा सीरम </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> ग्लास coverslip </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> क्षेत्रः गठन और neuronal भेदभाव </td></tr><tr><td> पाली - एल Lysine </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> इंसुलिन transferrin सेलेनियम (आईटीएस) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> आर एंड डी सिस्टम </td><td> 236 - ईजी </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> आर एंड डी सिस्टम </td><td> 233 FB </td></tr><tr><td> Neurobasal मध्यम </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 सीरम मुक्त अनुपूरक </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> ग्लूटामेट </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

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Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

हम यहाँ चूहे और मानव नाक cavities से घ्राण mucosa biopsying के लिए एक विधि का वर्णन. इन बायोप्सी या तो मस्तिष्क रोगों में आणविक विसंगतियों की पहचान करने या multipotent वयस्क स्टेम कोशिकाओं है कि मस्तिष्क आघात / रोग के पशु मॉडल में कोशिका प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया जा सकता है अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

नाक कृन्तकों या मनुष्य से घ्राण स्टेम सेल को अलग

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

एक कीट घ्राण प्रणाली से electrophysiological माप

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

अलग LacZ व्यक्त माउस इनर कान प्रवाह cytometry का उपयोग ऊतकों से कक्ष

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के द्वारा विस्तार<em&gt; Utero में</em&gt; Electroporation या वायरल Stereotaxic इंजेक्शन

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

अलगाव और भ्रूण murine तंत्रिका ट्यूब से तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की संस्कृति

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

मानव तंत्रिका के समुच्चय के लिए एक cGMP-लागू विस्तार विधि स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं pluripotent स्टेम सेल या भ्रूण के मस्तिष्क के ऊतकों से निकाली

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

मानव pluripotent से तंत्रिका शिखा पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के फीडर से मुक्त व्युत्पत्ति स्टेम सेल

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

मानव pluripotent स्टेम सेल से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन भेदभाव निर्देशित

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

मॉडलिंग तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; इन विवो</em&gt; Cortical Astrocytes या सशर्त, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उपयोग

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

लेजर कैद Microdissection के साथ नाक बायोप्सी संयुक्त माध्यम से प्राप्त की घ्राण न्यूरॉन्स: मानसिक विकार में उपचार प्रतिक्रिया का अध्ययन के लिए एक संभावित दृष्टिकोण

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

माउस भ्रूण स्टेम सेल इन विट्रो से न्यूरोनल भेदभाव

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...