Name: isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00
Duration: 9 min 19 s
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この作品は、財政ANR（アジャンス国立デラルシェルシュ）、AFM（協会フランセーズcontre LESミオパシー）、PACAとIRMEでフェダー（研究所デルシェルシュシュールラMoelle épinièreらL&#39; Encéphale）によってサポートされていました。我々は感謝して時間経過の記録中の彼女の効率的な助けのためにマリーピエールブランチャード（ジャンロシュ研究所）に感謝します。

1。ラット嗅粘膜のコレクション<ol><li>純粋培養フードのDMEM / HAM F12培養液で満たさthree 35ミリメートルのペトリ皿を準備することから始めます。 </li><li>安楽死のいずれかの方法は、金融機関の動物のケアと使用に関する委員会で事前に承認を受けた有資格者によって実施されている必要があります。ラットではそのようなケタミン/キシラジンとして麻酔のペントバルビタールナトリウムまたは他の注射の形態で深い麻酔を入力した後、頭部を除去すると皮膚を取り除く。吸入麻酔薬は避けるべきである。麻酔の妥当性は斬首前につま先のピンチによって評価される。はさみで下顎を外して、骨鉗子の助けを借りて、両側の顔面の筋肉を排除。 </li><li>切歯の後ろから始めて、骨鉗子で鼻腔、一度に片側を覆って骨を取り除く。嗅覚甲介は鼻の奥にあるオレンジ/茶色の器官として見えてくる。 </li><li>繊細な鉗子で甲を捨てる。垂直板、篩板と鼻腔の天井の弧：26ゲージの針を使用して、3つの線に沿って組織を切断することにより隔壁に横たわって嗅粘膜を分離する。 </li><li>両側に生検を収集し、DMEM / HAM F12を充填したシャーレに移す。この手順では、発症の安楽死から10分を上回ってはいけません。 </li><li>今、粘液を除去するために、培地充填ペトリ皿に生検を2回転送する。 </li></ol> 2。ヒトの嗅粘膜のコレクション<ol><li>この手順は、関連するローカル倫理委員会（S）に準拠して、耳、鼻、喉（ENT）外科医によって行われるべきである、とすべての外来患者はインフォームドコンセントのフォームに署名する必要があります。 </li><li> 0 °または30 °硬性内視鏡（直径4mm）を使用して、鼻腔の両方を検査し、ポリープまたは炎症性病変の推定存在を評価する。考慮中隔の偏差を取って、最高の鼻腔を選択してください。 </li><li>綿棒を使用して、10分間、エピネフリンとリドカイン等の局所麻酔薬を、適用する。 </li><li> throughcut篩骨鉗子で、中鼻甲介の内側面のルートまたは背内側領域における隔壁上にどちらか一方平方ミリメートル生検を収集する。 </li><li>嗅覚生検は、その後、DMEM / HAM F12を1 mlを充填した滅菌を2 mlのチューブに、滅菌針を用いて、転送されます。生検を培養培地に浸漬されていることを確認するために逆さにチューブを傾ける。 </li><li>冷蔵コンテナでチューブを挿入し、研究室に移送。この段階では、生検は、特定の脳の疾患に焦点を当てたり、幹細胞を生成するための処理の比較分子生物学的研究のためにそれ自体使用することができます。 </li></ol> 3。ヒトおよびラット粘膜から嗅覚幹細胞の単離<ol><li> DMEM / HAM F12で生検を洗ってください。 37℃で1時間、ディスパーゼIIソリューション（2.4 IU / ml）を1mlで満たしたシャーレに生検をインキュベート℃に</li><li>次に、回折反転光と解剖顕微鏡下で、嗅上皮は、ミクロスパチュラを用いて、基礎となる固有層から削除されます。 </li><li>嗅上皮は薄く、オレンジ/茶色の縞模様である粘膜固有層に比べて黒い背景の上に半透明に見えます。白い背景の上、上皮は灰色と固有層、茶色に見えます。 </li><li>一度精製された、DMEM / HAM F12で満たされたシャーレに粘膜固有層を転送する。 </li><li>組織は、齧歯類からのものである場合には、2つの25ゲージの針で小さな断片に固有層をカット。その後、コラゲナーゼIA 1mlで満たした15mlのチューブに曲を転送する。 </li><li>チューブに、滅菌したプラスチック製のピペットを使用して、組織を解離する。その後、37℃で10分間チューブをインキュベート℃に</li><li>解離を終了するには、軽くチューブを揺すりとCa -無料およびMg -フリーPBSで5分間に200 gで遠心9 mlを加える。 </li><li> 10％ウシ胎児血清、抗生物質やプラスチック製の培養皿上にプレートを添加したDMEM / HAM F12培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>今、組織が人間の場合は、後、200〜500μmのからの範囲の厚さ3〜4枚に固有層をスライス。 </li><li>独自の2 cmの直径の培養皿に各ストリップを挿入し、滅菌1.3センチメートルの直径のガラスカバースリップを持つ組織をカバーしています。 </li><li>その後、各培養皿に培養液500μlの培地（DMEM / HAM F12、10％ウシ胎児血清と抗生物質を補充）を追加します。 </li><li>いずれの組織型の場合は、2〜3日おき培養液を更新。 </li><li> 5〜7日後に、幹細胞は、培養皿を侵略を開始し、二週間後に彼らがコンフルエントにする必要があります。 、通路に達し、培養フラスコに細胞を移すされている場合コンフルエント。 </li></ol> 4。球の形成と神経Differe嗅覚幹細胞のntiation <ol><li>幹細胞の球を生成するには、37℃で2時間フラスコをインキュベートしますポリ- L -リジンとC。 （TEXT：5 g/cm2）。 </li><li>プレート治療フラスコで平方センチメートルあたり16000細胞の密度で細胞。 </li><li> 2日ごとに、培地の平方センチメートルあたり0.2ミリリットル（DMEM / HAM F12インスリン、トランスフェリン、セレン（ITS - X、1％）、EGF（50 ng / ml）およびFGF2（を添加した細胞を供給した50 ng / ml）を）。 </li><li> 2〜5日後、浮遊細胞の球とのどちらかに再プレートを収集したり、細胞療法の動物モデルに移植する前にそれらを解離する。 </li><li>ニューロン様細胞への嗅覚幹細胞を区別するには、B - 27、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及びグルタミン酸を含むNeurobasal培地で21日間飼育。 </li><li>その後、3日毎に培地の変更を行います。ニューロン様細胞は2〜3週間後に表示されます。 </li></ol> 5。代表的な結果： 鼻人間の外植片- outgrowing幹細胞が（図2A）急速に分裂していると、コンフルエントは1週間から2週間以内で到達できます。 stemnessの主要な機能の1つ、ネスチンの発現は、（図2B）を評価した。 EGF（50 ng / ml）およびFGF2（50 ng / mlの）を添加した無血清培地によるポリ- L -リジンで増殖させた場合、嗅幹細胞は、球体（図2C）を生じさせる。血清含有培地中で増殖させた場合、新たにメッキの球は、GFAP発現細胞を（〜50％）、チューブリン発現細胞（〜10〜15％）とO4 -発現細胞を（〜2から5パーセント）9（図を生じさせる2D - F）。しかし、球由来細胞の運命を変更することができます。例えば、B27とグルタミン酸、β- IIIチューブリン（図2G）とMAP2（図2H）を発現するニューロン様細胞への鼻の嗅覚幹細胞のほとんどを補充Neurobasal培地で増殖させた場合。 <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="図1"/> 図1実験の全体的なスキーム。嗅粘膜の生検は、ラットやヒトの鼻腔から切除されています。外植片は、脳疾患のバイオマーカーを同定することを目的と比較分子生物学的研究のためにそれ自体使用することができます。嗅覚幹細胞を単離するために、粘膜固有層と神経上皮との相互作用は、ディスパーゼIIの酵素で破砕されていると、45分後、上皮はマイクロスパチュラで削除されます。げっ歯類の嗅覚幹細胞は、さらにコラゲナーゼIAで粘膜固有層を解離によって選択されています。 outgrowing幹細胞がうまく全体を侵略するまで、人間の組織の場合は、嗅粘膜固有層の部分は、ガラスのカバースリップの下に培養される。増殖した後、適切な培地を用いて、嗅覚の幹細胞は、球を生成することができますまたはニューロン様細胞に分化する。嗅覚幹細胞は、iに使用することができます）修理の脳の疾患や外傷、またはii）中枢神経系の疾患の分子マーカーを特定する。イラストは、セルヴィエメディカルアートの助けを借りて作られています。 <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。文化と鼻の人間の嗅覚幹細胞の分化。粘膜固有層の植（）の外に増殖するヒト幹細胞は、血清含有培地で培養したとき、急速に分裂している。幹細胞はstemnessマーカーネスチン（B）を発現。ときにポリ- L -リジンコートしたプラスチックの上にプレーティングし、EGFとFGF2を添加した無血清培地で培養し、嗅覚幹細胞は球体（C）を生成する。球由来の血清を含む培養培地に播種した細胞、GFAP発現を生じさせる細胞を（〜50％）、チューブリン発現細胞（〜10〜15％）とO4 -発現細胞（〜2から5パーセント） 9（DF）。 B27とグルタミン酸を添加したNeurobasal培養培地中で増殖させた場合、それらはβ- IIIチューブリン（G）とMAP2（H）を発現するニューロン様細胞に分化する。

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R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss.">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li><li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson's+disease.">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li><li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice.">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia:+a+3-year+clinical+trial.">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

テクニックは、げっ歯類とヒトの嗅粘膜神経発達と神経変性疾患の原因だけでなく、病理学や心に傷を負った脳を修復するためのツールへの臨床研究のための有用なモデルを作るここで紹介。プロトコルは比較的簡単であり、容易に経験豊富な細胞生物学者によって行うことができる。生検と培養技術の成功率は高いです。 重要なステップ<ul><li>げっ歯類の嗅粘膜のコレクションの場合、それは安楽死と嗅覚組織の最終的な切除の間に10分の時間制限を超過しないことをお勧めします。 </li><li>げっ歯類の嗅覚粘膜固有層の解離は、通常、10分後に達成される。コラゲナーゼIAでインキュベーション。そうでない場合、我々は固有層のフロートの解離ビットの上清の翌日に収集することをお勧めします、200 gでそれを遠心分離し、機械的にも新たに細胞を再播種する前にパスツールピペットを用いて浮動ラミナを解離する。すでに付着した細胞を含む最初のウェルは、新鮮な培養液で満たされている。 </li><li>げっ歯類の組織よりもコンパクトです、人間の固有層、のために、我々は、酵素的解離はお勧めしません。組織はスライスされ、それぞれの外植片は、プラスチック製の皿の底とガラスのカバースリップの間に挿入されます。成功した文化は、その厚さの範囲は200〜500μmの外植片を含む。 </li></ul>実行可​​能な変更<ul><li>現在のプロトコルは、わずかにin vitroで嗅覚ニューロンを生成するために変更することができます。その目的のために、神経上皮は削除されていないと全体の嗅粘膜は、マッキルウェーンのチョッパー（200μmの厚さ）にスライスする。それぞれの外植片は、シャーレに播種し部分的に1時間乾燥し、FCS含有培地で再水和されています。最初の日のポストプレー中に、上皮と間葉系細胞は、外植片から成長。その後、ニューロンの前駆細胞はこの細胞層の上に移動し、ニューロンに分化する。 </li><li>嗅覚幹細胞の精製は、フローサイトメトリーを用いて達成することができます。特定の表面マーカーは、特性の紙11に発表されたリストから取得することができます。 </li><li>移植実験のために、それは嗅覚幹細胞がGFP陽性のラットの系統を使用することが可能です。このラット系統は、（スプラーグドーリー、eGFPのPGKプロモーターによって駆動される）ITERT（ナント、フランス）で利用可能です。人間の嗅覚幹細胞にGFP遺伝子を挿入するため、我々は、レンチウイルスの感染に基づいてメソッドを使用します。 </li><li>本論文では、嗅覚エクト - 間葉系幹細胞に焦点を当てています。しかし、興味の別のセルのタイプ、嗅覚鞘細胞は、同じ組織から精製することができる。我々は、彼らのコレクションと精製1,17のための方法を説明し、我々は対麻痺患者18の段階I / IIaの臨床試験のために人間の鼻鞘細胞を使用していました。 </li><li>間葉系幹細胞のスーパーファミリーのメンバーとして、OE - MSCは、脂肪細胞、骨細胞や心筋細胞11に区別するために、適切な培養条件で、可能です。 </li></ul>将来のアプリケーション<ul><li>我々はすでに自閉症、双極性障害、家族性自律神経失調症、パーキンソン病、アルツハイマー病や統合失調症2-7患者における細胞と分子の異常を研究するために、人間の嗅覚生検を使用している。理論的には、すべての脳疾患は、鼻生検または末梢嗅幹細胞を用いて研究することができます。 </li><li>げっ歯類と人間の鼻の嗅覚幹細胞はすでに健忘症、パーキンソン病、人工内耳の損傷や脊髄の外傷12月16日の動物モデルに移植されています。それは、アルツハイマー病、脳虚血、多発性硬化症の動物モデルにこれらの細胞を移植することが考えられる。 </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td colspan="3"> ラットの嗅粘膜のコレクション </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨鉗子</td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26ゲージの針</td><td>テルモ</td><td> NN - 2613R </td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> ヒトの嗅粘膜のコレクション </td></tr><tr><td>硬質内視鏡</td><td>カールストルツやリチャードウルフ医療</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エピネフリン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut篩骨鉗子</td><td>カールストルツやリチャードウルフ医療</td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 嗅覚幹細胞の分離 </td></tr><tr><td>ディスパーゼII </td><td>ロッシュ</td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ</td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 10270098 </td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>クニッテルグレイザー</td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> 球の形成と神経分化 </td></tr><tr><td>ポリ- L -リジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P - 1274 </td></tr><tr><td>インスリン、トランスフェリン、セレン（ITS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 236 - EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 233 - FB </td></tr><tr><td> Neurobasal培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B - 27無血清サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140122 </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030024 </td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans

鼻腔にある嗅粘膜には、、匂いを検出するのを担当しています。また、外部環境にさらされると、すべての生存する個人で簡単にアクセスされている場合にのみ神経組織です。その結果、この組織は病理学的な脳内の分子の異常を特定したり、細胞治療のための成体幹細胞を分離することを目指し、誰のためにユニークです。 脳疾患の分子異常がしばしば事後収集した神経組織のサンプルを用いて研究しています。しかし、この材料は多くの制限があります。対照的に、嗅粘膜は容易にアクセス可能であり、臭い1の感覚を失うことなく、安全に生検を実施することができます。したがって、嗅粘膜は1つが発達勉強できるような大人のヒト（例えば自閉症、統合失調症）2-4または神経変性（例えば、パーキンソン、アルツハイマー病）4,5疾患で、&quot;開いているウィンドウを&quot;提供します。嗅粘膜は4,6どちらの比較分子研究のためにまたは神経新生3,7でin vitroの実験で使用することができます。 嗅上皮はまた、ウイルス感染症の細菌汚染によって損傷されているものを、置き換えるために毎日新しいニューロンを生み出す神経組織です。この永久的な神経発生は、前駆細胞によって支えだけでなく、すなわち粘膜、神経上皮および基礎となる固有層8-10の両方のコンパートメント内に存在する幹細胞れている。我々は最近、粘膜固有層にある成体幹細胞を精製する方法を開発し、それらが密接に骨髄間葉系幹細胞（BM - MSC）に関連していることを実証した後、我々は（彼らの嗅覚エ​​クト - 間葉系幹細胞を命名OE - MSC）11。 興味深いことに、BM - MSCに比較した場合、OE - MSCは、高い増殖率、上昇clonogenicityと神経細胞に分化する傾向を表示します。我々は統合失調症とパーキンソン病の4の新しい候補遺伝子を明らかにする専用の研究を行うためにこれらの特性を利用した。我々と他にもOE - MSCは、脊髄の外傷12,13、人工内耳損傷14日以降またはパーキンソン病15または健忘症16の動物モデルにおいて、細胞治療のための候補者を約束していることが示されている。 本研究では、我々はラットとヒトでの嗅粘膜の生検する方法を提示する。収集した後、粘膜固有層は、酵素的に上皮と幹細胞から分離されている酵素的または非酵素的方法を用いて精製されています。精製された嗅覚幹細胞は、どちらの大量に増殖させ、液体窒素でバンクレジスタまたは球を形成したり、神経細胞に分化誘導することができる。これらの幹細胞はまた、比較オミクス（プロテオーム、エピ、トランスクリプトーム、ゲノム）研究に使用することができます。

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Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

ここでは、ラットおよびヒトの鼻腔から嗅粘膜をbiopsyingための方法を説明します。これらの生検は、脳疾患の分子異常を識別したり、脳の外傷/疾患の動物モデルの細胞移植に利用することができる多能性成体幹細胞を単離するどちらにも使用できます。

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

蛾嗅覚系の電気生理学的測定

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

神経科学

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

モデル星細胞腫発症機序<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで鼻生検併用して得られた嗅覚ニューロン：精神疾患における治療応答を研究するために潜在的なアプローチ

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...