Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Dit werk werd uitgevoerd door studenten van Southwestern Oklahoma State University, Weatherford OK. Dit werk werd ondersteund door NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT en OCAST HR09-137S. De vsm1 (ok1468) mutant werd geïsoleerd door de Oklahoma Gene Knockout Consortium. De auteurs danken Dan Stefanovic en Tanner Wheeler voor hun waardevolle hulp tijdens de uitvoering van het project.

<ol>
	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit onderzoek ontwikkelden we een eenvoudig, gebruiksvriendelijk protocol dat gebruikt kan worden om bepaald genexpressieprofielen ten grondslag liggen aan verschillende biologische fenomenen. In dit protocol werd totaal RNA voor het eerst geïsoleerd en behandeld worden met behulp van DNase I. Onze manier van RNA-isolatie is sterk vereenvoudigd door het weglaten van fenol extractie en het gebruik van harsen affiniteit voor het opruimen 5,6. Kortom, C. elegans cuticule en celmembranen waren gebarsten te openen door ze te bevriezen met vloeibare stikstof nematoden en slijpen met moleculaire hars. Vervolgens geëxtraheerde RNA werd behandeld met DNase ik al eerder cDNA synthese. De volgende stap werd toegevoegd aan niet-specifieke hybridisaties minimum te beperken; RNA-monsters besmet met genomisch DNA kunnen introduceren interferentie en produceren veel vals-positieven. Dan, wild type en VSM-1 (ok1468) mutant cDNA&#39;s werden getagd met Cy3 en Cy5 vastleggen sequenties en gehybridiseerd op C. elegans microarrays verkregen via de GCAT programma. Dit systeem is gevoeliger dan soortgelijke producten, en zijn twee kleuren ontwerp vermindert het aantal benodigde arrays, wat resulteert in meer tijd en kosten efficiency 7,8. Bovendien wordt dit systeem niet vereist dat de gespecialiseerde apparatuur van andere soortgelijke systemen; dan ook, deze procedure zou worden gebracht in elke standaard laboratorium setting 7. Ten derde, TL-gehybridiseerd reeks beelden werden geanalyseerd met behulp van de open source software MAGICTool, en genexpressie profielen werden gemaakt. MAGICTool is een gebruiksvriendelijk programma dat gemakkelijk wordt gebruikt door mensen van alle niveaus, van de undergraduate tot de post-doctoraat. Echter, optimale prestaties vereist grote geheugen beschikbaarheid. Ten slotte kandidaat-genen verkregen met behulp van microarray analyse werden gevalideerd met real time PCR. Hoewel de genomische benadering is een efficiënte methode voor het bestuderen van biologische verschijnselen, zijn er een aantal beperkingen een rekening moet worden gehouden. De eerste, ondanks de specificiteit van deze microarray protocol, afschriften binnen een familie zijn niet te onderscheiden van elkaar als de gedrukte oligonucleotide wordt genomen uit geconserveerde sequenties. Real time PCR compenseert overeenkomsten binnen een gen familie en kan zelfs onderscheid maken tussen specifieke isovormen van hetzelfde gen. Echter, met real time PCR is het een uitdaging om echte controles die worden uitgedrukt even het hele levensduur van een organisme te vinden. Vanwege dit, zullen de resultaten worden de relatieve. Een proteomics benadering is een alternatief voor onze techniek. Individuele eiwitten kunnen worden geïsoleerd met behulp van 2D-gelelektroforese en geïdentificeerd met massa-spectrometrie. Onze studies tonen aan dat met name veel leden van de Major Sperma Protein (MSP) familie worden geïnduceerd in VSM-1 mutant nematoden met verbeterde synaptische densiteit. MSP&#39;s zijn uniek voor C. elegans en zijn verantwoordelijk voor eicel rijping en ovulatie. Chai 1 heeft aangetoond dat de regulering van presynaptische Bouton aantal en grootte op de neuromusculaire junctie in fruitvliegen waarschijnlijk wordt gecontroleerd door moleculen die bestaan ​​uit Major Sperma Protein domeinen. Studies van Tsuda en zijn collega&#39;s hebben aangetoond dat twee Major Sperma eiwitdomeinen kunnen dienen als liganden voor Ephrine receptoren, triggering receptor tyrosine kinase signalering cascades. Bovendien, real-time PCR analyse gevalideerd en versmald microarray resultaten op een lid van het MSP-familie, MSP-32. Bij elkaar genomen, het werk dat hier wordt gepresenteerd is een genoom-brede analyse van een centrale neurowetenschap dilemma evenals de macht van de undergraduate onderzoek in het wetenschappelijke streven.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Catalog # </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> RNA Later </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Moleculaire Slijpen Resin </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNAse-vrij Agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel Prep / Running Buffer </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal Sample Loading Dye </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase set </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT Enzym en 5X reactiebuffer </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Array 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Geschoren zalmsperma DNA </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS-oplossing </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA synthese kit </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Synapsen zijn samengesteld uit een presynaptische actieve zone in de signalering cel en een postsynaptische terminal in de doelcel. In het geval van chemische synapsen, worden berichten gedragen door neurotransmitters vrijgelaten uit presynaptische terminals en ontvangen door postsynaptische receptoren op cellen. Onze vorige onderzoek in Caenorhabditis elegans heeft aangetoond dat VSM-1 negatief exocytose regelt. Bovendien, de analyse van synapsen in de VSM-1 mutanten toonde aan dat dieren die bij gebrek aan een volledig functionele VSM-1 zijn gestegen synaptische connectiviteit. Op basis van deze voorlopige bevindingen hebben we de hypothese dat C. elegans VSM-1 kan spelen een cruciale rol in synaptogenese. Om deze hypothese te testen, werd dubbel-gelabeld microarray analyse uitgevoerd, en gen expressie profielen werden bepaald. De eerste, totaal RNA werd geïsoleerd, omgekeerd getranscribeerd in cDNA, en gehybridiseerd met het DNA microarrays. Dan, in silico-analyse van de fluorescente probe hybridisatie bleek significante inductie van vele genen die coderen voor de leden van de grote sperma eiwitfamilie (MSP) in mutanten met verbeterde synaptogenese. MSP&#39;s zijn de belangrijkste component van het sperma in C. elegans en blijken nematoden eicel rijping en ovulatie signaal. In fruitvliegen, Chai en zijn collega&#39;s toonden aan dat een MSP-achtige moleculen presynaptische Bouton aantal en de grootte te regelen bij de neuromusculaire junctie. Bovendien, de analyse uitgevoerd door Tsuda en collega&#39;s twee gesuggereerd dat MSP&#39;s kunnen optreden als liganden voor Eph receptoren en activeren receptor tyrosine kinase signalering cascades. Ten slotte, real-time PCR-analyse bevestigd dat het gen dat codeert voor het MSP-32 is geïnduceerd in VSM-1 (ok1468) mutanten. Bij elkaar genomen, blijkt uit onderzoek uitgevoerd door ons laboratorium aangetoond dat de VSM-1 mutanten een aanzienlijke stijging van de synaptische densiteit, die kunnen worden gemedieerd door MSP-32 signaalfunctie.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen bepalen<em&gt; C. elegans</em&gt;, En real-time PCR werd gebruikt om te valideren en te kwantificeren microarray data.

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Lineaire versterking Mediated PCR - Lokalisatie van genetische elementen en karakterisering van Onbekende flankerend DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...