Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
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Diese Arbeit wurde von Studenten im Südwesten Oklahoma State University, Weatherford OK durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT und OCAST HR09-137S unterstützt. Die vsm1 (ok1468)-Mutante wurde von der Oklahoma Gene Knockout Consortium isoliert. Die Autoren danken Dan Stefanovic und Tanner Wheeler für ihre wertvolle Hilfe bei der Projektabwicklung.

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	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In dieser Studie entwickelten wir eine einfache, benutzerfreundliche Protokoll, das bestimmt Genexpressionsprofile zugrunde liegenden verschiedenen biologischen Phänomenen verwendet werden können. In diesem Protokoll wurde Gesamt-RNA zunächst isoliert und behandelt mit DNase I. Unsere Methode der RNA-Isolierung hat sich dramatisch durch Weglassen Phenolextraktionen und mit Affinität Harze für aufzuräumen 5,6 vereinfacht. Kurz, C. elegans Kutikula und die Zellmembranen wurden geknackt offen durch Einfrieren Nematoden mit flüssigen Stickstoff und Mahlen mit molekularen Harz. Anschließend extrahierte RNA wurde mit DNase I vor cDNA-Synthese behandelt. Die späteren Schritt wurde hinzugefügt, um unspezifische Hybridisierungen zu minimieren; RNA-Proben mit genomischer DNA kontaminiert sein könnten Störungen führen und produzieren viele False-Positives. Dann Wildtyp und VSM-1 (ok1468) mutierten cDNAs wurden mit Cy3 und Cy5 Capture-Sequenzen markiert und hybridisiert auf C. elegans-Microarrays durch die GCAT Programm erhalten. Dieses System ist empfindlicher als vergleichbare Produkte, und die Zwei-Farben-Design nimmt die Anzahl der Arrays benötigt, was zu einer größeren Zeit-und Kosteneffizienz 7,8. Darüber hinaus wird dieses System nicht die Spezialausrüstung von anderen ähnlichen Systemen, daher könnte dieses Verfahren in jedem Standard-Labor-Stufe 7 erreicht werden. Drittens fluoreszierenden hybridisierten Array Bilder wurden unter Verwendung des Open-Source-Software MAGICTool und Genexpressionsprofile erstellt wurden. MAGICTool ist ein benutzerfreundliches Programm, das leicht von Einzelpersonen aller Erfahrungsstufen verwendet wird, aus dem Grundstudium auf die Post-doc. Allerdings erfordert eine optimale Leistung großer Speicher vorhanden. Schließlich erhalten Kandidatengene mittels Microarray-Analyse wurden mit real time PCR validiert. Obwohl der genomischen Ansatz ist eine effiziente Methode für die Untersuchung biologischer Phänomene, gibt es einige Einschränkungen man in Betracht ziehen sollten. Erstens: Trotz der Besonderheit dieses Microarray-Protokoll sind Transkripte innerhalb einer Familie nicht voneinander, wenn die gedruckte Oligonukleotid aus konservierten Sequenzen genommen wird. Real-time PCR kompensiert Ähnlichkeiten innerhalb einer Genfamilie und kann sogar zwischen einzelnen Isoformen des gleichen Gens unterscheiden. Doch mit real time PCR ist eine Herausforderung für wahre Steuerelemente, die gleichmäßig über einen Organismus die Lebensdauer zum Ausdruck zu finden. Aus diesem Grund werden die Ergebnisse relativ sein. Ein Proteom-Ansatz ist eine Alternative zu unserer Technik. Individuelle Proteine ​​isoliert mittels 2D-Gelelektrophorese und identifizierte sich mit der Massenspektrometrie werden. Unsere Studien zeigen, dass speziell viele Mitglieder der Major Sperm Protein (MSP) Familie in vsm-1 Mutante Nematoden mit erhöhter Synapsendichte induziert werden. MSPs sind einzigartig für C. elegans und sind verantwortlich für Eizellreifung und Ovulation. Chai 1 hat gezeigt, dass die Regulierung der präsynaptischen Bouton Anzahl und Größe an der neuromuskulären Synapse in Fruchtfliegen wahrscheinlich durch Moleküle, die Große Sperm Protein-Domänen gesteuert. Studien von Tsuda und Kollegen 2 haben gezeigt, Große Sperm Protein-Domänen können als Liganden für Ephrine Rezeptoren dienen, Auslösung Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Signalkaskaden. Darüber hinaus validiert real time PCR-Analyse und ab Microarray-Ergebnisse zu einem Mitglied der MSP-Familie, MSP-32 verengt. Zusammengenommen stellt die hier vorgestellte Arbeit eine genomweite Analyse eines zentralen Neurowissenschaften Dilemma sowie die Macht der Bachelor-Forschung in der wissenschaftlichen Arbeit.

<table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Catalog # </td><td> Firma </td></tr><tr><td> RNA Später </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Molecular Reibharzes </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNase-freies Agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel Prep / Running Buffer </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal Beispiel Loading Dye </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase Set </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT Enzyme und 5x Reaktionspuffer </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Array 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Gescherte Lachssperma-DNA </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS-Lösung </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA Synthesis Kit </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Synapsen sind eines präsynaptischen aktiven Zone in die Signalisierung Zelle und einer postsynaptischen Terminals in die Zielzelle zusammen. Im Falle von chemischen Synapsen, werden die Nachrichten von Neurotransmittern aus präsynaptischen freigegeben und erhielt von Rezeptoren auf postsynaptische Zellen durchgeführt. Unsere bisherige Forschung in Caenorhabditis elegans hat gezeigt, dass VSM-1 negativ reguliert Exozytose. Darüber hinaus zeigte die Analyse der Synapsen in vsm-1-Mutanten, dass die Tiere fehlt eine voll funktionsfähige VSM-1 erhöht haben synaptischen Verbindungen. Basierend auf diesen vorläufigen Ergebnissen stellten wir die Hypothese, dass C. elegans VSM-1 kann eine entscheidende Rolle spielen in Synaptogenese. Um diese Hypothese zu testen, wurde doppelt markierten Mikroarray-Analyse durchgeführt, und Genexpressionsprofile wurden ermittelt. Erstens, Gesamt-RNA wurde isoliert, revers in cDNA transkribiert und auf einem DNA-Mikroarrays. Dann zeigte in-silico-Analyse von fluoreszierenden Sonden-Hybridisierung signifikante Induktion von vielen Genen, die für Mitglieder der großen Spermien-Protein-Familie (MSP) in Mutanten mit verbesserter Synaptogenese. MSPs sind der Hauptbestandteil von Spermien in C. elegans und scheinen Nematoden Eizellreifung und Ovulation Signal. In Fruchtfliegen nachgewiesen Chai und Kollegen 1, MSP-ähnliche Moleküle präsynaptischen Bouton Anzahl und Größe zu regulieren an der neuromuskulären Synapse. Darüber hinaus schlug Analyse von Tsuda und Mitarbeitern durchgeführt 2, dass MSPs können als Liganden für Eph-Rezeptoren und lösen Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Signalkaskaden zu handeln. Schließlich bestätigt real time PCR-Analyse, dass das Gen für MSP-32 in vsm-1 (ok1468) Mutanten induziert wird. Zusammengenommen hat sich die Forschung in unserem Labor durchgeführt gezeigt, dass VSM-1-Mutanten eine signifikante Zunahme der synaptischen Dichte, die von MSP-32-Signalisierung vermittelt werden könnte.

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray-Analyse wurde durchgeführt, um genetische Expression Profile in bestimmen<em&gt; C. elegans</em&gt; Und real-time PCR wurde verwendet, um zu bestätigen und zu quantifizieren Microarray-Daten.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

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