Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
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यह काम पश्चिमी ओकलाहोमा स्टेट यूनिवर्सिटी, Weatherford ठीक है पर स्नातक छात्रों द्वारा किया गया था. इस काम NSF RUI - 0963258, एनआईएच ठीक INBRE 2P20RR016478, GCAT और OCAST HR09-137S द्वारा समर्थित किया गया था. vsm1 उत्परिवर्ती (ok1468) ओकलाहोमा जीन नॉकआउट कंसोर्टियम द्वारा पृथक किया गया. लेखकों परियोजना के निष्पादन के दौरान उनके बहुमूल्य मदद के लिए दान Stefanovic और टान्नर व्हीलर धन्यवाद.

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	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस अध्ययन में हम एक आसान, उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रोटोकॉल है कि निर्धारित जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल अंतर्निहित विभिन्न जैविक घटना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित की है. इस प्रोटोकॉल में, पहले कुल शाही सेना और अलग था DNase मैं का उपयोग कर आरएनए अलगाव की हमारी विधि नाटकीय रूप से फिनोल extractions omitting और 5,6 साफ आत्मीयता रेजिन का उपयोग करके सरल किया गया है इलाज. संक्षेप सी. एलिगेंस cuticule और कोशिका झिल्ली तरल नाइट्रोजन और आणविक राल के साथ पीसने के साथ ठंड नेमाटोड से टूट खुले थे . अगला, निकाले आरएनए DNase मैं के साथ सीडीएनए संश्लेषण से पहले इलाज किया गया था. बाद में एक चरण unspecific hybridizations को कम करने के लिए जोड़ा गया है, शाही सेना जीनोमिक डीएनए के साथ दूषित नमूनों हस्तक्षेप परिचय और कई झूठी सकारात्मक का उत्पादन कर सकता है. फिर, जंगली प्रकार और VSM 1 (ok1468) उत्परिवर्ती cDNAs Cy3 और Cy5 कब्जा दृश्यों के साथ टैग किए गए थे और सी. पर संकरित एलिगेंस प्रोटीन GCAT कार्यक्रम के माध्यम से प्राप्त की. इस प्रणाली के इसी तरह के उत्पादों की तुलना में अधिक संवेदनशील है, और अपने दो रंग डिजाइन की जरूरत सरणियों की संख्या घट जाती है, अधिक समय और लागत दक्षता 7,8 में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली के अन्य समान सिस्टम के विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं करता, इसलिए, इस प्रक्रिया को किसी भी मानक प्रयोगशाला 7 स्थापित करने में पूरा किया जा सकता है. तीसरा, फ्लोरोसेंट संकरित सरणी छवियों खुला स्रोत सॉफ्टवेयर MAGICTool का उपयोग विश्लेषण किया गया, और जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल बनाया गया. MAGICTool कि आसानी से सब अनुभव के स्तर के व्यक्तियों द्वारा उपयोग किया जाता है एक उपयोगकर्ता के अनुकूल कार्यक्रम है स्नातक से के बाद डॉक्टर की उपाधि. हालांकि, अनुकूलतम प्रदर्शन के बड़े स्मृति की उपलब्धता की आवश्यकता है. अन्त में, उम्मीदवार जीन माइक्रोएरे विश्लेषण का उपयोग कर वास्तविक समय पीसीआर के साथ मान्य थे प्राप्त किया. हालांकि जीनोमिक दृष्टिकोण जैविक घटना के अध्ययन के लिए एक कारगर तरीका है, वहाँ कुछ सीमाएँ एक ध्यान में रखना चाहिए रहे हैं. सबसे पहले, इस माइक्रोएरे प्रोटोकॉल की विशिष्टता के बावजूद एक परिवार के भीतर टेप एक दूसरे से अप्रभेद्य हैं अगर मुद्रित oligonucleotide संरक्षित दृश्यों से लिया है. वास्तविक समय पीसीआर एक जीन परिवार के भीतर समानता के लिए क्षतिपूर्ति और यहां तक ​​कि एक ही जीन की विशिष्ट isoforms के बीच भेद कर सकते हैं. हालांकि, वास्तविक समय पीसीआर के साथ यह सच नियंत्रण है कि एक जीव उम्र भर में समान रूप से व्यक्त कर रहे हैं खोजने के लिए एक चुनौती है. इस वजह से, परिणाम रिश्तेदार हो जाएगा. एक प्रोटिओमिक हमारे तकनीक के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण है. व्यक्तिगत प्रोटीन 2D जेल वैद्युतकणसंचलन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ की पहचान का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. हमारे अध्ययन विशेष रूप से पता चलता है कि मेजर शुक्राणु प्रोटीन (एमएसपी) परिवार के कई सदस्यों VSM 1 बढ़ाया synaptic घनत्व के साथ उत्परिवर्ती नेमाटोड में प्रेरित कर रहे हैं. MSPS सी. के लिए अद्वितीय हैं एलिगेंस और oocyte परिपक्वता और ovulation के लिए जिम्मेदार हैं . एक चाय का प्रदर्शन किया है कि presynaptic bouton और फल मक्खियों में neuromuscular जंक्शन पर संख्या और आकार के विनियमन की संभावना मेजर शुक्राणु प्रोटीन डोमेन वाले अणुओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है . Tsuda और उनके सहयोगियों द्वारा अध्ययन दो मेजर शुक्राणु प्रोटीन डोमेन Ephrine रिसेप्टर्स के लिए ligands के रूप में सेवा, रिसेप्टर tyrosine kinase cascades संकेत ट्रिगर हो सकता है प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण मान्य और नीचे संकुचित msp परिवार, msp-32 के एक सदस्य के लिए माइक्रोएरे परिणाम है. साथ में ले ली है, यहाँ प्रस्तुत काम एक केंद्रीय तंत्रिका विज्ञान दुविधा के एक जीनोम चौड़ा विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वैज्ञानिक प्रयास में स्नातक अनुसंधान की शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है.

<table border="1"><tbody><tr><td> घटक </td><td> # सूचि </td><td> कंपनी </td></tr><tr><td> बाद में शाही सेना </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> आण्विक पीस राल </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy मिनी किट </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNase मुक्त agarose ले </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X जेल बफर / तैयारी रनिंग </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> शाही सेना मिलेनियम मार्कर </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal नमूना लोड हो रहा है डाई </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase सेट </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute किट </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> आरटी एनजाइम और 5X रिएक्शन बफर </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> 350 ऐरे </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick पीसीआर शोधन किट </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X एसएससी </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> सामन शुक्राणु डीएनए sheared </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> एसडीएस समाधान </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> डीटीटी EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript सीडीएनए संश्लेषण किट </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> बुद्धि SYBR ग्रीन Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Synapses संकेत और लक्ष्य कक्ष में एक postsynaptic टर्मिनल सेल में एक presynaptic सक्रिय क्षेत्र की रचना कर रहे हैं. रासायनिक synapses के मामले में, संदेश presynaptic टर्मिनल से जारी है और postsynaptic कोशिकाओं पर रिसेप्टर्स द्वारा प्राप्त न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा किया जाता है. हमारे Caenorhabditis एलिगेंस में पिछले अनुसंधान से पता चला है कि वीएसएम-1 नकारात्मक exocytosis नियंत्रित. इसके अतिरिक्त, VSM-1 म्यूटेंट में synapses के विश्लेषण से पता चला है कि एक पूरी तरह कार्यात्मक वीएसएम-1 वृद्धि हुई है synaptic कनेक्टिविटी की कमी पशुओं. इन प्रारंभिक निष्कर्षों के आधार पर, हम धारणा है कि सी. एलिगेंस वीएसएम - एक synaptogenesis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, डबल - लेबल माइक्रोएरे विश्लेषण किया था, और जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारित किया गया है. पहले कुल शाही सेना पृथक किया गया, विपरीत सीडीएनए लिखित, और डीएनए संकरित. फिर, फ्लोरोसेंट जांच संकरण के विश्लेषण में सिलिको बढ़ाया synaptogenesis साथ म्यूटेंट में कई प्रमुख शुक्राणु प्रोटीन (एमएसपी) परिवार के सदस्यों के लिए कोडिंग जीन की महत्वपूर्ण शामिल से पता चला. MSPS सी. में शुक्राणु का एक प्रमुख घटक हैं एलिगेंस और निमेटोड oocyte परिपक्वता और ovulation के संकेत दिखाई देते हैं. फल मक्खियों में, चाय और 1 सहयोगियों दिखा दिया कि एमएसपी की तरह अणुओं neuromuscular जंक्शन पर presynaptic bouton संख्या और आकार को विनियमित. इसके अलावा, विश्लेषण Tsuda और सहकर्मियों के द्वारा प्रदर्शन दो सुझाव दिया है कि MSPS Eph रिसेप्टर्स और ट्रिगर रिसेप्टर tyrosine kinase संकेत cascades के लिए ligands के रूप में कार्य कर सकते हैं. अंत में, वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण पुष्टि की है कि एमएसपी 32 के लिए कोडिंग के जीन (ok1468) VSM-1 म्यूटेंट में प्रेरित है. साथ में ले ली, हमारी प्रयोगशाला द्वारा निष्पादित अनुसंधान दिखाया है कि-1 VSM म्यूटेंट synaptic घनत्व में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है, जो एमएसपी 32 संकेतन द्वारा मध्यस्थता हो सकता है.

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

माइक्रोएरे विश्लेषण में आनुवंशिक अभिव्यक्ति प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए आयोजित किया गया<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; और वास्तविक समय पीसीआर माइक्रोएरे डेटा को मान्य है और यों इस्तेमाल किया गया था.

में आनुवंशिक अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण सी. एलिगेंस माइक्रोएरे और वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

स्थिर ट्रांसजेनिक सी. Microinjection का उपयोग एलिगेंस पीढ़ी

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

वैश्विक जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण एक Zebrafish Oligonucleotide माइक्रोएरे प्लेटफार्म का उपयोग करना

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर थर्मो वैज्ञानिक Solaris qPCR परख

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

जीन एक्सप्रेशन का पन्ना ऐश छिद्रक में विश्लेषण ( Agrilus planipennis</emपीसीआर ->) का प्रयोग मात्रात्मक रीयल टाइम

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

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प्री - सूक्ष्म RNAs और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर Arrays (qPCR) का उपयोग microRNAs की रूपरेखा

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

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बायोकेमिकल और उच्च Throughput वसा द्रव्यमान का सूक्ष्म आकलन<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

एंटीबॉडी धुंधला में<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; &quot;रुक क्रैकिंग&quot; का प्रयोग

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

रैखिक प्रवर्धन मध्यस्थता पीसीआर - अज्ञात flanking डीएनए के आनुवंशिक तत्व और विशेषता का स्थानीयकरण

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

जांच-आधारित वास्तविक समय पीसीआर microRNAs के मात्रात्मक मापन के लिए दृष्टिकोण

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag विश्लेषण - एक उच्च Throughput, Sc2.0 जीनोटाइपिंग के लिए वास्तविक समय पीसीआर परख

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...