Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
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Questo lavoro è stato eseguito da studenti universitari a sud-ovest Oklahoma State University, OK Weatherford. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT e OCAST HR09-137S. L&#39;(ok1468) vsm1 mutante è stato isolato dal Consorzio Knockout Gene Oklahoma. Gli autori ringraziano Dan Stefanovic e Tanner Wheeler per il loro aiuto prezioso durante l&#39;esecuzione del progetto.

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	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo studio abbiamo sviluppato un semplice protocollo facile da usare che può essere usato per determinare profili di espressione genica di base vari fenomeni biologici. In questo protocollo, l&#39;RNA totale è stato isolato e trattato con DNasi I. Il nostro metodo di isolamento dell&#39;RNA è stata notevolmente semplificata dall&#39;eliminazione fenolo e l&#39;utilizzo di resine affinità per ripulire 5,6. In breve, C. elegans cuticule membrane cellulari e sono state incrinate, aperto da nematodi congelamento con azoto liquido e rettifica con resina molecolare. Successivamente, l&#39;RNA estratto è stato trattato con DNasi I prima sintesi del DNA. Il passaggio successivo è stato aggiunto a minimizzare ibridazioni aspecifiche; campioni di RNA contaminato da DNA genomico potrebbe introdurre interferenze e producono molti falsi positivi. Poi, tipo selvatico e VSM-1 (ok1468) cDNA mutanti sono stati taggati con Cy3 e Cy5 sequenze di acquisizione e ibridato su C. microarray elegans ottenuti tramite il programma GCAT. Questo sistema è più sensibile rispetto a prodotti simili, e il suo sofisticato disegno bicolore diminuisce il numero di array necessari, con conseguente maggiore efficienza dei costi di tempo e 7,8. Inoltre, questo sistema non richiede attrezzature specializzate di altri sistemi simili, quindi, questa procedura potrebbe essere realizzato in qualsiasi ambiente standard di laboratorio 7. In terzo luogo, le immagini fluorescenti serie ibridata sono stati analizzati utilizzando il software a sorgente aperto MAGICTool, e profili di espressione genica sono stati creati. MAGICTool è un programma di facile uso che può essere facilmente utilizzato da individui di ogni livello di esperienza, dalla laurea al post-dottorato. Tuttavia, la performance ottimale richiede grande disponibilità di memoria. Infine, geni candidati ottenuti con l&#39;analisi microarray sono state validate con PCR in tempo reale. Anche se l&#39;approccio genomico è un metodo efficace per studiare fenomeni biologici, ci sono alcune limitazioni si dovrebbe prendere in considerazione. In primo luogo, nonostante la specificità di questo protocollo microarray, trascrizioni all&#39;interno di una famiglia sono indistinguibili l&#39;uno dall&#39;altro se il oligonucleotide stampata è tratto da sequenze conservate. PCR in tempo reale compensa somiglianze all&#39;interno di una famiglia di geni e può anche distinguere tra isoforme specifiche dello stesso gene. Tuttavia, con PCR in tempo reale è una sfida per trovare controlli vero che sono espressi allo stesso modo per tutta la durata della vita di un organismo. A causa di questo, i risultati saranno relativi. Un approccio proteomico è una alternativa alla nostra tecnica. Singole proteine ​​possono essere isolate mediante gel elettroforesi 2D e identificati con la spettrometria di massa. I nostri studi mostrano in particolare che molti membri delle principali proteine ​​dello sperma (MSP) famiglia sono indotti a VSM-1 nematodi mutante con una maggiore densità sinaptica. MSP sono unici a C. elegans e sono responsabili della maturazione dell&#39;ovocita e l&#39;ovulazione. Chai 1 ha dimostrato che la regolamentazione del numero Bouton presinaptica e la dimensione a livello della giunzione neuromuscolare nei moscerini della frutta è probabile controllato da molecole contenenti principali domini delle proteine ​​dello sperma. Studi di Tsuda e colleghi hanno dimostrato due principali domini di proteine ​​dello sperma possono servire come leganti per i recettori Ephrine, innescando cascate della tirosin-chinasi del recettore di segnalazione. Inoltre, l&#39;analisi real time PCR convalidato e ristretto i risultati dei microarray a un membro della famiglia msp, msp-32. Nel loro insieme, il lavoro qui presentato rappresenta un genoma analisi di un dilemma centrale neuroscienze così come la potenza di ricerca universitari nello sforzo scientifico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Catalogo </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Più tardi dell&#39;RNA </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Molecolare resina Rettifica </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNasi-free Agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel Prep / Running Buffer </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Gliossale campione colorante di caricamento </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNasi set </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT enzimi e tampone di reazione 5X </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Array 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> SSC 20X </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Tranciati Salmone DNA dello sperma </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS Soluzione </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript Kit di sintesi del DNA </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Sinapsi sono composti da una zona presinaptica attivo nella segnalazione cellulare e un terminale postsinaptici nella cella di destinazione. Nel caso di sinapsi chimiche, i messaggi vengono trasportati da neurotrasmettitori rilasciati dai terminali presinaptici e ricevuti dai recettori sulle cellule postsinaptici. Le nostre ricerche precedenti in Caenorhabditis elegans ha dimostrato che VSM-1 regola negativamente esocitosi. Inoltre, l&#39;analisi di sinapsi in VSM-1 mutanti hanno mostrato che gli animali privi di una connettività completamente funzionale VSM-1 sono aumentati sinaptica. Sulla base di questi risultati preliminari, abbiamo ipotizzato che C. elegans VSM-1 può giocare un ruolo cruciale nella sinaptogenesi. Per verificare questa ipotesi, a doppio etichettati analisi microarray è stata eseguita, e profili di espressione genica sono stati determinati. In primo luogo, l&#39;RNA totale è stato isolato, inversamente trascritto in cDNA, e ibridato al DNA microarray. Poi, in silico-analisi di ibridazione sonda fluorescente rivelato induzione significativo di molti geni che codificano per i membri della famiglia principali proteine ​​dello sperma (MSP) in mutanti con sinaptogenesi migliorata. MSP è il principale componente di sperma in C. elegans e sembrano segnale maturazione degli ovociti nematodi e l&#39;ovulazione. Nel moscerino della frutta, Chai e colleghi hanno dimostrato che 1 MSP-come le molecole regolano il numero e la dimensione bouton presinaptica a livello della giunzione neuromuscolare. Inoltre, l&#39;analisi eseguita da Tsuda e collaboratori due suggerito che MSP può agire come leganti per i recettori Ef e innescare tirosin-chinasi del recettore cascate di segnalazione. Infine, l&#39;analisi PCR in tempo reale corroborata che il gene che codifica per MSP-32 è indotta a VSM-1 (ok1468) mutanti. Nel loro insieme, la ricerca effettuata dal nostro laboratorio ha dimostrato che VSM-1 mutanti hanno un significativo aumento della densità sinaptica, che potrebbe essere mediata da MSP-32 di segnalazione.

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Analisi microarray è stato condotto per determinare profili di espressione genetica<em&gt; C. elegans</em&gt;, E real-time PCR è stato utilizzato per convalidare e quantificare i dati di microarray.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

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