Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
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この作品は、南西部のオクラホマ州立大学、ウェザーフォードのOKで学部学生により行われました。この作品は、NSF RUI - 0963258、NIH OK - INBRE 2P20RR016478、GCATとOCAST HR09 - 137Sによってサポートされていました。 vsm1（ok1468）変異体は、オクラホマ州の遺伝子ノックアウトコンソーシアムにより単離した。 著者らは、プロジェクトの実行中に貴重な助けのためにダンStefanovicとタナーウィーラーに感謝。

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	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

本研究では、様々な生命現象の根底にある決定遺伝子発現プロファイルに使用することができる簡単な、ユーザーフレンドリーなプロトコールを開発した。このプロトコルでは、トータルRNAは、最初に単離され、RNA単離の我々の方法が劇的にフェノール抽出を省略し、5,6をクリーンアップに対する親和性樹脂を使用することによって簡素化されているのDNase Iを用いて処理した。簡単に言えば、C.虫の cuticuleと細胞膜は液体窒素と分子樹脂の研削と凍結線虫でクラック-開いていた。次に、抽出したRNAは、cDNA合成の前にDNase Iで処理した。後のステップは、非特異的ハイブリダイゼーションを最小限に抑えるために添加し、ゲノムDNAに汚染されたRNAサンプルは、干渉を紹介し、多くの偽陽性を作り出すことができる。次に、野生型およびVSM - 1（ok1468）変異体のcDNAをCy3とCy5のキャプチャシーケンスでタグ付けとCにハイブリダイズさせた。 GCATプログラムを通じて取得elegansはマイクロアレイ。このシステムは、同様の製品よりも高感度であり、そしてその2つの色のデザインは、より大きな時間とコストの効率化7,8の結果、必要な配列の数を減少させる。さらに、このシステムは、他の同様のシステムの特殊な装置を必要としないため、このプロシージャは、任意の標準的な実験室の設定7で達成することができる。第三に、蛍光ハイブリダイズ配列のイメージは、オープンソースソフトウェアのMAGICToolを用いて分析し、遺伝子発現プロファイルが作成されました。 MAGICToolは学部からポスドクに、簡単にすべての経験レベルの人々によって利用されるユーザーフレンドリーなプログラムです。しかし、最適なパフォーマンスは、大容量メモリの可用性を必要とします。最後に、マイクロアレイ解析を用いて得られた候補遺伝子をリアルタイムPCRで検証された。 ゲノムアプローチは生命現象を研究するための効率的な方法ですが、1つは考慮すべきいくつかの制限があります。印刷されたオリゴヌクレオチドが保存された配列から取られている場合、最初、このマイクロアレイのプロトコルの特異性にもかかわらず、家族内での転写物は区別できない。リアルタイムPCRは、遺伝子ファミリー内の類似性を補正し、さらに、同じ遺伝子の特定のアイソフォームを区別することがあります。しかし、リアルタイムでのPCRは、それは、生物の寿命全体に均等に発現される真のコントロールを見つけることが課題です。このため、結果は相対的になります。プロテオミクスのアプローチは、我々の技術への1つの代替です。個々のタンパク質は、2次元ゲル電気泳動と質量分析法で同定を用いて単離することができる。 我々の研究は、特に主要な精子のタンパク質（MSP）の家族の多くのメンバーが強化されたシナプス密度とVSM - 1変異体線虫に誘発されることを示している。 MSPはCに固有のものです虫と卵成熟と排卵のための責任があります。チャイ1は、ショウジョウバエの神経筋接合部におけるシナプスブートンの数とサイズの調節が可能性が高い主な精子のタンパク質ドメインを含む分子によって制御されることが実証されています。津田らによる研究では、2つの主要な精子のタンパク質のドメインは、受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達カスケードを誘発する、Ephrine受容体のリガンドとして働くことが実証されている。また、リアルタイムPCR解析には、検証とMSPの家族の一員、MSP - 32へのマイクロアレイ結果を絞り込むこと。一緒になって、ここで紹介する作品は、中央の神経科学のジレンマのゲノムワイドな解析だけでなく、科学的試みで学部生の研究の力を表します。

<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> カタログ＃ </td><td> 会社 </td></tr><tr><td> RNAその後</td><td> AM7020 </td><td>アンビオン</td></tr><tr><td>分子研削樹脂</td><td> 786から138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td> 74104 </td><td>キアゲン</td></tr><tr><td> RNaseフリーアガロースLE </td><td> AM9040 </td><td>アンビオン</td></tr><tr><td> NorthernMax Glyの10Xゲルのプレップ/ランニングバッファー</td><td> 8678 </td><td>アンビオン</td></tr><tr><td> RNAミレニアムマーカー</td><td> AM7150 </td><td>アンビオン</td></tr><tr><td>グリオキサールサンプルローディングダイ</td><td> 8551 </td><td>アンビオン</td></tr><tr><td> DNase処理セット</td><td> 79254 </td><td>キアゲン</td></tr><tr><td>したRNeasyアプライキット</td><td> 74204 </td><td>キアゲン</td></tr><tr><td> RT酵素と5倍の反応バッファー</td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td>配列350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAクイックPCR精製キット</td><td> 28104 </td><td>キアゲン</td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td>剪断サケ精子DNA </td><td> AM9680 </td><td>アンビオン</td></tr><tr><td> SDS溶液</td><td> V6551 </td><td>プロメガ</td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA合成キット</td><td> 170-8890 </td><td> BioRad社</td></tr><tr><td> iQのSYBRグリーンスーパーミックス</td><td> 170-8880 </td><td> BioRad社</td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

シナプスは、標的細胞における細胞シグナル伝達とシナプス端末の前シナプスのアクティブゾーンで構成されています。化学シナプスの場合には、メッセージは、シナプス後細胞上の受容体がシナプス前終末から放出されると、受信した神経伝達物質によって行われている。 線虫（Caenorhabditis elegans）における当社のこれまでの研究では、VSM - 1はマイナスのエキソサイトーシスを調節することが示されている。また、VSM - 1変異体におけるシナプスの解析ではその完全に機能するVSM - 1は増加しているシナプスの接続性を欠いている動物。これらの予備調査結果に基づいて、我々は仮説を立てたそのC.虫 VSM - 1は、シナプス形成において重要な役割を果たす可能性があります。この仮説をテストするには、二重標識マイクロアレイ解析を行い、遺伝子発現プロファイルを決定した。最初に、全RNAを単離し、逆にcDNAに転写し、DNAマイクロアレイにハイブリダイズした。その後、蛍光プローブのハイブリダイゼーションのインシリコの解析では、強化されたシナプス形成と変異の主要な精子のタンパク質ファミリー（MSP）のメンバーのためにコードする多くの遺伝子の有意な誘導が明らかになった。 MSPはC言語で精子の主要なコンポーネントです。 虫と線虫の卵成熟と排卵を知らせるために表示されます。ショウジョウバエでは、チャイと同僚1は MSPのような分子は神経筋接合部でシナプスブートンの数とサイズを調節することが明らかに。また、津田と同僚によって行われる分析は、2 MSPSがエペソの受容体とトリガーの受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達カスケードのためのリガンドとして作用する可能性が示唆された。最後に、リアルタイムPCR解析には、MSP - 32をコードする遺伝子は、VSM - 1（ok1468）変異体では誘導されることを確証した。一緒になって、私たちの研究室で実施した調査では、VSM - 1変異体は、MSP - 32シグナル伝達によって媒介される可能性がシナプス密度の大幅な増加を、持っていることを示している。

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

マイクロアレイ解析はで遺伝子発現プロファイルを決定するために実施された<em&gt; C.エレガンス</em&gt;、およびリアルタイムPCRはマイクロアレイのデータを検証し、定量化するために使用されていました。

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

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Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

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