Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
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이 작품은 사우스 웨스턴 오클라호마 주립 대학, 웨더 확인에서 학부 학생들이 수행되었다. 이 작품은 루이 NSF - 0963258, NIH OK - INBRE 2P20RR016478, GCAT 및 OCAST HR09 - 137S에 의해 지원되었다. vsm1 (ok1468) 돌연변이가 오클라호마 진 넉아웃 컨소시엄에 의해 고립되었다. 저자는 프로젝트 수행 중에 귀중한 도움을 댄 Stefanovic와 태너 휠러 감사드립니다.

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	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 연구에서는 다양한 생물 학적 현상을 기본 결정 유전자 발현 프로필을 사용할 수있는 쉽고 사용자 친화적인 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜에서 총 RNA가 먼저 격리와 RNA의 분리 우리의 방법은 크게 페놀 extractions를 생략하고 5,6 정리를위한 화성 수지를 사용하여 간단하게되었습니다 DNase I.를 사용하여 치료했습니다. 간단히, C. 엘레간스의 cuticule 및 세포 세포막은 액체 질소와 분자 수지로 분쇄와 냉동 nematodes에 의해 금이 - 오픈되었습니다. 다음 추출된 RNA는 cDNA 합성 전에 DNase I로 치료했다. 나중에 단계는 unspecific hybridizations을 최소화하기 위해 추가되었다; 게놈 DNA와 RNA 오염된 샘플 간섭을 소개하고 많은 거짓 - 반응을 생산 수 있습니다. 그런 다음, 야생 입력하고 vsm - 1 (ok1468) 돌연변이의 cDNAs은 Cy3와 Cy5 캡처 시퀀스 태그와 C.로 hybridized되었다 엘레간스의 microarrays은 GCAT 프로그램을 통해 얻은. 이 시스템은 유사 제품보다 더 민감하고, 그 두 색상의 디자인은 큰 시간과 비용 효율 7,8의 결과, 필요한 배열의 수를 감소시킵니다. 또한이 시스템은 다른 유사한 시스템의 전문 장비가 필요하지 않으므로,이 절차는 표준 실험실 설정 7 수행할 수 없습니다. 셋째, 형광 hybridized 배열 이미지는 오픈 소스 소프트웨어 MAGICTool를 사용하여 분석되었고, 유전자 발현 프로파일이 만들어졌습니다. MAGICTool은 학부에서 포스트 박사로, 쉽게 모든 경험 수준의 개인에 의해 활용되는 사용자 친화적인 프로그램입니다. 그러나, 최적의 성능은 대용량 메모리 가용성을 필요로합니다. 마지막으로, 후보 유전자 실시간 PCR과 검증되었습니다 microarray 분석을 사용하여 획득하였습니다. 게놈 접근 방식이 생물 학적 현상을 연구를위한 효율적인 방법에도 불구하고, 하나는 고려 소요됩니다 몇 가지 제한이있다. 인쇄 oligonucleotide가 보존 시퀀스에서 가져온 경우 첫째,이 microarray 프로토콜의 특이성에도 불구하고, 가족 내에서 성적은 서로 구별할 수 있습니다. 실시간 PCR은 유전자 가족 내에서 공통점에 대한 보상, 심지어 같은 유전자의 특정 isoforms 구별 수 있습니다. 그러나, 실시간 PCR과 동일하게 생명체의 수명에 걸쳐 표현 진정한 컨트롤을 찾기 위해 도전입니다. 이 때문에, 결과는 상대적인 것입니다. proteomic 접근은 우리의 기술을 하나의 대안입니다. 개별 단백질은 2D 겔 전기 영동과 질량 분석계로 확인을 사용하여 격리 수 있습니다. 우리의 연구는 특히 주요 정자 단백질 (MSP) 가족의 여러 구성원이 향상된 시냅스 밀도 vsm - 1 돌연변이 nematodes에서 유도되는 보여줍니다. MSPs는 C.에 고유한 엘레간스 및 oocyte의 성숙과 배란에 대한 책임이 있습니다. 차이 1 과일 파리의 신경근육학 교차점에서 presynaptic 부통 번호 및 크기의 조절 가능성이 주요 정자 단백질 도메인을 포함하는 분자에 의해 제어됩니다 것을 보여주었다. 쓰다 및 동료에 의해 ​​연구는 2 개의 주요 정자 단백질 도메인 수용체 티로신 키나제 신호 폭포를 실행, Ephrine 수용체에 대한 리간드 역할을 수 증명하고있다. 또한, 실시간 PCR 분석 확인 및 MSP 가족, MSP - 32 중 하나를 회원에게 microarray 결과를 좁혀. 함께 촬영, 여기에서 제시한 작품은 중앙 신경 과학의 딜레마의 게놈 차원의 분석뿐만 아니라 과학적 노력의 학부 연구의 파워를 나타냅니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> RNA 나중 </td><td> AM7020 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> 분자 연삭 수지 </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> 74,104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Rnase없는 아가로 오스 LE </td><td> AM9040 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X 젤 준비 / 실행 버퍼 </td><td> 8678 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> RNA 밀레니엄 마커 </td><td> AM7150 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> Glyoxal 샘플 로딩 다이 </td><td> 8551 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> DNase 세트 </td><td> 79,254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute 키트 </td><td> 74,204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT 효소와 배 반응 완충액 </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> 배열 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR의 정제 키트 </td><td> 28,104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> 가지각색 연어 정자 DNA </td><td> AM9680 </td><td> 앰비온 </td></tr><tr><td> SDS 솔루션 </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA 합성 키트 </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> IQ SYBR 그린 Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

시냅스는 대상 세포에 신호 세포와 postsynaptic 터미널에서 presynaptic 활성 영역으로 구성되어 있습니다. 화학 시냅스의 경우, 메시지는 presynaptic 터미널에서 발표하고 postsynaptic 수용체 세포에 신경 전달 물질에 의해 접수 실시하고 있습니다. Caenorhabditis 엘레간스에있는 우리 이전의 연구는 VSM - 1 부정 exocytosis을 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한 vsm - 1 돌연변이에 시냅스의 분석 보여준 완벽한 기능 VSM - 1 증가 시냅스 연결을 부족한 동물. 이러한 예비 조사 결과를 바탕으로, 우리는 가상 그 C. 엘레간스 VSM - 1 synaptogenesis에서 중요한 역할을 수 있습니다. 이 가설을 테스트하려면 두 번 표시 microarray 분석이 수행되었고, 유전자 발현 프로파일이 결정됩니다. 첫째, 총 RNA는 고립되었다, reversely cDNA로 베꼈는데하고, DNA를 microarrays에 hybridized. 그런 다음, 형광 프로브 하이브 리다이 제이션의 인 silico 분석 향상된 synaptogenesis과 돌연변이의 주요 정자 단백질 가족 (MSP)의 회원 코딩 많은 유전자의 중요한 유도을 공개했다. MSPs는 C로 정자의 주요 구성 요소입니다 엘레간스 및 선충류의 oocyte의 성숙과 배란 신호를 나타납니다. 과일 파리에서 차이와 동료 1 MSP 같은 분자가 신경근육학 교차로에서 presynaptic 부통 번호와 크기를 규제 것을 보여주었다. 또한, 쓰다 및 동료에 의해 ​​수행 분석 2 MSPs는 에프 수용체와 트리거 수용체 티로신 키나제의 신호 폭포에 대한 리간드 역할을 수 있습니다 것을 제안했습니다. 마지막으로, 실시간 PCR 분석 MSP - 32에 대한 코딩 유전자가 vsm - 1 (ok1468) 돌연변이의 유발 것을 뒷받침. 함께 찍은, 우리 실험실에 의해 수행 연구 vsm - 1 돌연변이 MSP - 32 신호에 의해 중재 수 시냅스 밀도에 상당한 증가를 가지고 나타났습니다.

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray 분석은 유전자 표현의 프로필을 결정하기 위해 실시되었다<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 실시간 PCR은 microarray 데이터를 확인하고 수치로 사용되었습니다.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

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Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

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Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

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연구

생물학

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