Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Detta arbete utfördes av studenter vid sydvästra Oklahoma State University, Weatherford OK. Detta arbete stöddes av NSF Rui-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT och OCAST HR09-137S. Den vsm1 (ok1468) mutant isolerades från Oklahoma Gene Knockout Consortium. Författarna tackar Dan Stefanovic och Tanner Wheeler för deras värdefulla hjälp under projektets genomförande.

<ol>
	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

I denna studie har vi utvecklat ett enkelt, användarvänligt protokoll som kan användas för att bestämmas genuttrycksprofilerna bakom olika biologiska fenomen. I detta protokoll var totalt RNA först isoleras och behandlas med hjälp av DNas I. Vår metod för RNA-isolering har förenklats dramatiskt genom att utelämna fenol extraktioner och använda affinitet hartser för sanering 5,6. Kortfattat, C. elegans cuticule och cellmembran var spruckna öppna genom frysning nematoder med flytande kväve och slipning med molekylär harts. Därefter extraherade RNA behandlades med DNas jag innan cDNA syntes. Den senare steg inkom minimera ospecifik hybridizations, RNA-prover förorenade med genomiska DNA skulle kunna införa störningar och producera många falskt positiva. Då vild typ och VSM-1 (ok1468) mutant cDNAs var märkta med Cy3 och Cy5 sekvenser fånga och hybridiseras på C. elegans microarrays erhållits genom GCAT programmet. Detta system är mer känsliga än liknande produkter, och tvåfärgad design minskar antalet nödvändiga arrayer, vilket resulterar i mer tid och kostnadseffektivitet 7,8. Dessutom kräver detta system inte de specialiserade utrustning av andra liknande system, och därför kunde detta förfarande ske i någon standard laboratoriemiljö 7. Tredje, fluorescerande hybridiseras rad bilder analyserades med hjälp av öppen MAGICTool källkod, och genuttryck profiler skapades. MAGICTool är ett användarvänligt program som lätt utnyttjas av individer av alla erfarenheter nivåer, från grundutbildning till efter doktorsexamen. Kräver dock optimal prestanda stort minne tillgänglighet. Slutligen erhålls kandidatgener med hjälp av microarray-analys har validerats i realtid PCR. Även om genomikaspekter är en effektiv metod för att studera biologiska fenomen, det finns vissa begränsningar man bör ta hänsyn till. Först, trots den särskilda karaktären hos denna microarray protokoll, avskrifter inom en familj är omöjliga att skilja från varandra, om den tryckta oligonukleotid är tagen från bevaras sekvenser. Realtids PCR kompenserar för likheterna inom en gen familj och kan även skilja mellan specifika isoformer av samma gen. Men med realtid PCR är det en utmaning att hitta sanna kontroller som uttrycks lika i hela organismens livslängd. På grund av detta kommer resultatet vara relativ. En proteomik tillvägagångssätt är ett alternativ till vår teknik. Enskilda proteiner kan isoleras med hjälp av 2D-gelelektrofores och identifieras med masspektrometri. Våra studier visar just att många medlemmar i Major spermier Protein (MSP) familj är induceras i VSM-1 mutant nematoder med ökad synaptisk densitet. MSPs är unika till C. elegans och ansvarar för äggcellen mognad och ägglossningen. Chai 1 har visat att regleringen av presynaptiska Bouton antal och storlek i den neuromuskulära förbindelsen i bananflugor sannolikt styrs av molekyler som innehåller stora domäner Spermiernas Protein. Studier av Tsuda och kollegor 2 har visat Major Spermier Protein domäner kan tjäna som ligander för Ephrine receptorer utlöser receptor tyrosinkinas signalering kaskader. Dessutom i realtid PCR-analys valideras och minskat ner microarray resultat till en medlem av MSP familjen, MSP-32. Sammantaget representerar arbetet presenteras här en genomet hela analys av en central neurovetenskap dilemma liksom kraften i grundutbildningen forskning i den vetenskapliga strävan.

<table border="1"><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Catalog # </td><td> Företag </td></tr><tr><td> RNA Senare </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Molekylär Slipning Resin </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74.104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNas-fri Agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel Prep / löpande buffert </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal Exempel laddningsfärg </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNas in </td><td> 79.254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74.204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT Enzyme och 5X Reaktionsbufferten </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Array 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> 28.104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Klippt Lax spermiens DNA </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS-lösning </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA syntes Kit </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Grön Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Synapser består av en presynaptisk aktiv zon i signalering cellen och en postsynaptiska terminalen i målcellen. När det gäller kemiska synapser, är meddelanden som bärs av signalsubstanser frigörs från presynaptiska terminaler och tas emot av receptorer på postsynaptiska celler. Vår tidigare forskning inom Caenorhabditis elegans har visat att VSM-1 negativt reglerar exocytos. Dessutom visade analysen av synapser i VSM-1 mutanter att djur som saknade en fullt fungerande VSM-1 har ökat synaptisk anslutning. Baserat på dessa preliminära resultat, hypoteser vi att C. elegans VSM-1 kan spela en avgörande roll i synaptogenesis. För att testa denna hypotes, var dubbel-märkt microarray analys och genuttryck profiler fastställdes. Först total RNA var isolerade, omvänt transkriberas till cDNA och hybridiseras till DNA microarrays. Sedan avslöjade i silico-analys av fluorescerande probe hybridisering signifikant induktion av många gener som kodar för medlemmar av de stora spermier proteinet familj (MSP) i mutanter med ökad synaptogenesis. MSPs är den största delen av spermier i C. elegans och verkar signalen mognad nematod äggcell och ägglossning. I bananflugor visade Chai och kollegor 1 som MSP-liknande molekyler som reglerar presynaptiska Bouton antal och storlek i den neuromuskulära förbindelsen. Dessutom föreslås en analys med Tsuda och medarbetare två som MSPs kan verka som ligander för Ef receptorer och utlöser receptor tyrosinkinas signalering kaskader. Slutligen bekräftas i realtid PCR-analys att den gen som kodar för MSP-32 är induceras i VSM-1 (ok1468) mutanter. Sammantaget har forskning utförd av vårt laboratorium visat att VSM-1 mutanter har en betydande ökning av synaptisk densitet, vilket kan vara medierad av MSP-32-signalering.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analys utfördes för att bestämma genetiska uttryck profiler<em&gt; C. elegans</em&gt;, Och realtids-PCR har använts för att validera och kvantifiera microarray-data.

Fastställande genuttryck profiler i C. elegans Använda Microarray och Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Global Gene Expression analys med en Zebrafish plattform Oligonucleotide microarray

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kvantitativa realtids-PCR med Thermo Scientific Solaris qPCR analys

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Analys av genuttryck i Emerald Ash tillväxtborr ( Agrilus planipennis) Med kvantitativa realtid-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering av Pre-mikro-RNA och mikroRNA hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biokemisk och hög kapacitet Mikroskopisk bedömning av fettmassa i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linjär Förstärkning medierad PCR - Lokalisering av genetiska element och karakterisering av Okänd Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...