Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Bu çalışma, Weatherford Tamam Güneybatı Oklahoma State University&#39;de lisans öğrencileri tarafından yapıldı. Bu çalışma, NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT ve OCAST HR09-137S tarafından desteklenen oldu. Vsm1 (ok1468) mutant Oklahoma Gen Nakavt Konsorsiyumu tarafından izole edilmiştir. Yazarlar, Dan Stefanovic ve Tanner Wheeler, projenin yürütülmesi sırasında değerli yardım için teşekkür ederim.

<ol>
	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, çeşitli biyolojik olayların altında yatan belirlenen gen ekspresyon profilleri için kullanılabilir, kolay, kullanıcı dostu protokol geliştirmiştir. Bu protokolde, toplam RNA ilk olarak izole ve RNA izolasyon yöntemi dramatik fenol ekstraksiyon atlayarak ve 5,6 kadar temizlemek için yakınlık reçine kullanılarak basitleştirilmiş oldu DNaz I. kullanılarak tedavi edildi . Kısaca, C. elegans derisinden köklerine ve hücre zarları, sıvı azot ve moleküler reçine ile taşlama ile dondurma nematod kırık açık . Ardından, çıkarılan RNA, cDNA sentezi önce DNaz I ile tedavi edildi. Sonraki adım belirsiz döllemeler en aza indirmek için eklendi; genomik DNA ile kontamine RNA örnekleri girişime tanıtmak ve birçok yanlış pozitif üretebilir. Sonra, vahşi tip ve VSM-1 (ok1468) mutant cDNAs Cy3 ve Cy5 yakalama dizileri ile etiketlenmiş ve C üzerine melezleşmiştir elegans mikroarray&#39;ler GCAT programı aracılığıyla elde edilmiştir. Bu sistem, benzer ürünlere göre daha daha duyarlı olup, iki renkli tasarımı, daha fazla zaman ve maliyet verimliliği 7,8, gerekli dizilerin sayısı azalır. Ayrıca, bu sistem diğer benzer sistemleri, özel ekipman gerektirmez, bu nedenle, bu yordamı herhangi bir standart laboratuvar ortamında 7 başarılı olabilir. Üçüncü olarak, floresan melezleşmiş dizi görüntüleri, açık kaynak kodlu yazılım MAGICTool kullanılarak analiz edildi ve gen ekspresyon profilleri oluşturuldu. MAGICTool lisans, doktora sonrası, tüm deneyim seviyesindeki kişiler tarafından kolay kullanılır bir kullanıcı dostu bir programdır. Ancak, optimal performans, geniş bellek kullanımını gerektirir. Son olarak, aday genler, gerçek zamanlı PCR ile valide mikroarray analizi kullanılarak elde edilmiştir. Genomik yaklaşımı biyolojik olgunun eğitim için etkili bir yöntem olmasına rağmen, dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk basılı oligonükleotid korunmuş dizileri alınırsa, bu mikroarray protokol özgüllüğü rağmen, bir aile içinde transkript birbirinden ayırt edilemez. Gerçek zamanlı PCR bir gen ailesi içinde benzerlikler dengeler ve hatta aynı genin belirli izoformları arasındaki farkı ayırt edebilir. Ancak, gerçek zamanlı PCR ile eşit bir organizmanın ömrü boyunca ifade doğrudur denetimlerini bulmak için bir meydan okumadır. Bu nedenle, sonuç bağlı olacaktır. Proteomik yaklaşım, bizim teknik bir alternatif. Bireysel proteinler 2D jel elektroforezi ve kütle spektrometresi ile özdeşleşmiş kullanılarak izole olabilir. Çalışmalarımız özellikle gelişmiş sinaptik yoğunluğu ile VSM-1 mutant nematod indüklenen Binbaşı Sperm Protein (MSP) ailesinin birçok üyesi olduğunu göstermektedir. MSP C&#39;ye kadar özeldir elegans ve oosit olgunlaşma ve yumurtlama için sorumludur. Chai 1 meyve sinekleri nöromüsküler kavşakta presinaptik bouton sayısını ve boyutunu düzenlenmesi büyük olasılıkla Binbaşı Sperm protein etki alanı içeren moleküller tarafından kontrol edildiğini göstermiştir . Tsuda ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalar, 2 Binbaşı Sperm protein etki reseptör tirozin kinaz sinyalizasyon kaskadlar tetikleme, Ephrine reseptörler için ligandlar olarak hizmet verebilir göstermiştir. Ayrıca, gerçek zamanlı PCR analizi, doğrulanmış ve mikroarray sonuçları, msp-32 msp ailesinin bir üyesi aşağı daralmış. Birlikte ele alındığında, burada sunulan iş merkezi bir nörobilim ikilem bir genom analiz gibi bilimsel çaba içinde lisans araştırma gücünü temsil eder.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Katalog # </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> RNA daha sonra </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Moleküler Taşlama Reçine </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Rnase ücretsiz Agaroz LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Jel Hazırlık / Tampon </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal Örnek Yükleniyor Boya </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNaz seti </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT Enzim ve 5X Reaksiyon Tamponu </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Dizi 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Arıtma Kiti </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Somon Sperm DNA makaslanmış </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS Çözüm </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA Sentezi Seti </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Yeşil Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Sinapslar hedef hücre sinyalizasyon hücre ve postsinaptik terminal presinaptik aktif bir bölge oluşur. Durumda kimyasal sinaps, mesajlar presinaptik terminaller salınan ve postsinaptik hücreleri üzerindeki reseptörler tarafından alınan nörotransmitterler tarafından yapılmaktadır. Caenorhabditis elegans Bizim daha önceki araştırma, olumsuz VSM-1 ekzositoz düzenleyen göstermiştir . Ayrıca, VSM-1 mutant sinaps analizi göstermiştir ki tamamen işlevsel bir VSM-1 artmıştır sinaptik bağlantı yoksun hayvanlar. Bu ön bulgulara dayanarak, hipotez olduğunu C. elegans VSM-1 sinaptogenez önemli bir rol oynayabilir. Bu hipotezi test etmek için, çift etiketli mikroarray analizi yapıldı ve gen ekspresyon profilleri belirlendi. İlk olarak, total RNA izole edildi, ters cDNA transkripsiyonu ve DNA mikrodizilerinin melezleşmiştir. Sonra,-siliko floresan prob hibridizasyon analizi en büyük sperm protein ailesi (MSP) üyeleri kodlayan birçok genin mutant gelişmiş sinaptogenez önemli indüksiyon saptandı. MSP C. sperm en önemli bileşeni elegans ve nematod oosit olgunlaşması ve ovulasyon sinyal görünür. Meyve sinekleri, Chai ve arkadaşları 1 MSP-benzeri moleküller, nöromüsküler kavşakta presinaptik bouton sayısını ve boyutunu düzenleyen olduğunu göstermiştir . Ayrıca, Tsuda ve arkadaşları tarafından yapılan analiz 2 MSP Efesliler reseptörleri ve tetik tirozin kinaz sinyal kaskadlar ligandlar olarak hareket edebilir önerdi. Son olarak, gerçek zamanlı PCR analizi MSP-32 kodlayan gen VSM-1 (ok1468) mutantlar indüklenen olduğunu doğruladı. Birlikte ele alındığında, laboratuvar tarafından yapılan araştırma, VSM-1 mutantlar sinyalizasyon MSP-32 aracılı olabilir sinaptik yoğunluğunda önemli bir artış olduğunu göstermiştir .

Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için yapıldı<em&gt; C. elegans</em&gt; Ve gerçek-zamanlı PCR mikroarray verileri doğrulamak ve ölçmek için kullanılmıştır.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...