Name: analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00
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Agradecemos a Kelly Jones para edição cuidadosa. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01MH 071316, Associação de Alzheimer, a Aliança Nacional de Pesquisa em Esquizofrenia e Depressão (NARSAD), ea Aliança Nacional para a Pesquisa do Autismo (Naar) (PP); American Heart Fellowship Associação de Pós-Doutorado (DPS); americano coração Fellowship Association Predoctoral (KMW).

O protocolo descrito aqui pode ser usado para examinar a morfologia espinha dendrítica e dinâmica de qualquer sistema primário de cultura. 1. Preparação de culturas primárias de neurônios corticais <ol><li> Prepare alta densidade culturas de neurônios corticais de ratos Sprague-Dawley E18 embriões e cultura em glia condicionado meio isento de soro 1-2. </li><li> Euthanize um rato grávidas (E18) de acordo com procedimentos ACUC; remover rapidamente útero (com fetos na ...

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li><li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines.">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li><li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals.">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure.">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li><li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity.">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li><li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines.">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity.">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li><li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6.">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li><li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling.">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li><li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly.">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li></ol>

As técnicas descritas acima para a análise quantitativa detalhada da morfologia da coluna dendríticas, densidade linear e mobilidade em qualquer fixo ou ao vivo neurônios corticais primárias estão focadas na compreensão dos efeitos da pós-sinápticos mecanismos que podem contribuir para neuropatologias. Uma abordagem semelhante pode ser usado para quantificar a morfologia da coluna ou motilidade em qualquer neurônio spiny, incluindo piramidais do hipocampo, Purkinje, ou neurônios espinhosos médios. <p cla...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> 18 milímetros de vidro tampa redonda No. 1,5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 milímetros quadrados tampa de vidro No. 1,5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 Kda </td></tr><tr><td> Mídia Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascent Scientific </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25-060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Solução de formaldeído </td><td> Merck Química </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Histologia grau </td></tr><tr><td> Cabras normais Serum </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Immunoresearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L) altamente cross-adsorvido </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (H + L) * altamente * cross-adsorvido </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Embalagens especiais </td></tr><tr><td> Câmara de estágio fechado imagem </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de controlador de temperatura </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph </td><td> Universal Imagem </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons

Espinhas dendríticas são os locais da maioria das conexões excitatórias no cérebro, e formam o compartimento pós-sináptico das sinapses. Estas estruturas são ricas em actina e tem se mostrado altamente dinâmico. Em resposta à plasticidade Hebbian clássica, bem como sinais de neuromoduladores, espinhas dendríticas pode mudar de forma e número, que é pensado para ser crítico para o refinamento dos circuitos neurais e processamento e armazenamento de informações dentro do cérebro. Dentro de espinhas dendríticas, uma complexa rede de proteínas ligação sinais extracelulares com o cyctoskeleton actina permitindo o controle da morfologia da coluna dendríticas e número. Estudos neuropatológicos demonstraram que um número de estados de doença, que vão desde a esquizofrenia para transtornos do espectro do autismo, exibir morfologia anormal da coluna dendríticas ou números. Além disso, estudos genéticos recentes identificaram mutações em genes que codificam várias proteínas sinápticas, levando a sugestões de que estas proteínas podem contribuir para a plasticidade da coluna aberrante que, em parte, estão na base da fisiopatologia desses transtornos. A fim de estudar o potencial papel destas proteínas no controle morfologias espinha dendrítica / número, o uso de culturas de neurônios corticais oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, este sistema permite uma alta resolução de imagem das espinhas dendríticas em células fixo, assim como lapso de tempo imagens de células vivas. Em segundo lugar, este sistema in vitro permite a fácil manipulação da função da proteína pela expressão de proteínas mutantes, knockdown por construções shRNA, ou tratamentos farmacológicos. Estas técnicas permitem aos pesquisadores começam a dissecar o papel da doença proteínas associadas e prever como as mutações dessas proteínas podem funcionar in vivo.

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Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Numerosos estudos recentes identificaram mutações em proteínas sinápticas associada a patologias cerebrais. Primários cultivados neurônios corticais oferecem grande flexibilidade para examinar os efeitos destas proteínas doenças associadas na morfologia e motilidade espinha dendrítica.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Neurociência

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...