Name: chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Andrea Tedeschi para ajudar na definição das experiências ChIP inicial em laboratório e Lindner Ricco por sua contribuição para afinar as condições para ChIP. Este trabalho foi financiado pela Fundação Hertie, o Grant Fortune, Universidade de Tuebingen, ea DFG concede DI 1497/1-1 (todos concedida a Simone Di Giovanni).

1. Lesão do nervo ciático e coluna dorsal <ol><li> O animal é colocado sobre uma toalha cirúrgica e debaixo dela um thermopad está presente em todo o processo de manter a temperatura corporal do rato a 37 ° C. Todos os animais são anestesiados para a cirurgia com uma contínua isoflurano / O 2 administração. Os instrumentos cirúrgicos são autoclavados antes do procedimento. </li><li> De lesão ciática, ambos posteriores são cuidadosamente raspada, e depilação completa-se com removedor de pêl...

<ol>
	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

Este protocolo fornece um método para solicitar directamente sobre o meio ambiente cromatina durante a regeneração axonal no sistema nervoso adulto após lesão axonal. Ele incorpora o modelo de lesão DRG com imunoprecipitação da cromatina para sondar o ambiente de transcrição e epigenéticos após a lesão ou o PNS ou CNS. É particularmente útil para pesquisadores que gostariam de caracterizar suposta sítios de ligação para o seu fator de transcrição favorito, e para determinar se a ocupação destes loc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Tampão ChIP 10x </td><td> Sinalização celular </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> Tampão eluição 2x ChIP </td><td> Sinalização celular </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP Beads proteína G Grade Magnética </td><td> Sinalização celular </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Rack Punho Magna (8 também) </td><td> Millipore </td><td> 2-40 </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> MERCK </td><td> ONU 1888 </td></tr><tr><td> O formaldeído 37% </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> Solução Glycine 10x </td><td> Sinalização celular </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glicogênio </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> HBSS 10x </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Anticorpo histona H3 (coelho) </td><td> Sinalização celular </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normais coelho IgG </td><td> Sinalização celular </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Fenol / clorofórmio / álcool isoamílico </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Cocktail de protease Comprimidos Inibidores </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / ml) </td><td> Sinalização celular </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS tampão de lise </td><td> Norte do estado </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Equipamentos necessários </th></tr><tr><td> Sonicador </td></tr><tr><td> Micropistilo </td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

Axônios no sistema nervoso central (SNC) não se regeneram, enquanto as do sistema nervoso periférico (SNP) se regeneram de forma limitada após a lesão (Teng et al., 2006). Reconhece-se que os programas de transcrição essencial para crescimento de neuritos e axonal são reativados após lesão no PNS (Makwana et al., 2005). No entanto as ferramentas disponíveis para analisar regulação gênica neuronal in vivo são limitados e muitas vezes desafiador. Os gânglios da raiz dorsal (DRG) oferecem um sistema excelente modelo prejuízo, porque tanto o CNS e PNS são inervados por um axônio bifurcada proveniente da soma mesma. Os gânglios representar uma coleção discreta de corpos celulares, onde todos os eventos ocorrem de transcrição, e assim fornecer uma região claramente definida de atividade transcricional que pode ser facilmente reproduzível e retirado do animal. Lesão de fibras nervosas no PNS (por exemplo, nervo ciático), onde a regeneração axonal ocorre, deve revelar um conjunto de programas de transcrição que são distintas das respondendo a uma lesão similar no sistema nervoso central, onde a regeneração não ocorre (por exemplo, na medula espinhal ). Sites para o fator de transcrição de ligação, histona e modificação de DNA resultante da lesão a qualquer PNS ou SNC podem ser caracterizadas usando cromatina imunoprecipitação (chip). Aqui, nós descrevemos um protocolo chip usando tecido DRG fixo rato após lesão axonal. Esta poderosa combinação oferece um meio para caracterizar o ambiente cromatina pró-regeneração necessária para promover a regeneração axonal.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Nós apresentamos um método para imunoprecipitação da cromatina do tecido da raiz dorsal após lesão axonal gânglios. A abordagem pode ser usada para identificar locais de transcrição específicos fator determinante e importante modificação epigenética de histonas e DNA para a regeneração de axônios lesados ​​tanto no sistema nervoso periférico e central.

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Neurociência

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enriquecimento de Culturas de Neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal de Camundongos Adultos por Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...