Name: chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00
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Nos gustaría dar las gracias a Andrea Tedeschi para ayudar en el establecimiento de los experimentos inicial de fichas en el laboratorio y Lindner Ricco por su contribución a ajustar las condiciones para el chip. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Hertie, la subvención de Fortune, de la Universidad de Tubinga, y la DFG DI subvenciones 1497/1-1 (todos los concedidos a Simone Di Giovanni).

1. Columna dorsal ciático y la lesión del nervio <ol><li> El animal se coloca sobre un paño quirúrgico y por debajo de ella un thermopad está presente durante todo el procedimiento, manteniendo la temperatura corporal del ratón a 37 ° C. Todos los animales son anestesiados para una cirugía con una continua isoflurano / O 2 de la administración. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes del procedimiento. </li><li> Por lesiones ciático, ambos miembros posteriores son cuidadosa...

<ol>
	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

Este protocolo proporciona un método de preguntar directamente sobre el medio ambiente de la cromatina durante la regeneración axonal en el sistema nervioso adulto después de una lesión axonal. Se incorpora el modelo de lesión DRG con inmunoprecipitación de cromatina para investigar el entorno de la transcripción y epigenéticos posteriores a la lesión a cualquiera de los SNP o sistema nervioso central. Es particularmente útil para los investigadores que deseen para caracterizar putativo sitios de unión para e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Buffer chip 10 veces </td><td> Señalización Celular </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> Chip 2x Tampón de Elución </td><td> Señalización Celular </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> Grado chip de proteína G bolas magnéticas </td><td> Señalización Celular </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Bastidor de agarre Magna (8 también) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> MERCK </td><td> De las Naciones Unidas 1888 </td></tr><tr><td> 37% de formaldehído </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x solución de glicina </td><td> Señalización Celular </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glucógeno </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> HBSS 10x </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histona H3 de anticuerpos (conejo) </td><td> Señalización Celular </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> IgG normal de conejo </td><td> Señalización Celular </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Fenol / cloroformo / alcohol isoamílico </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Inhibidores de la proteasa Cocktail comprimidos </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinasa K (20 mg / ml) </td><td> Señalización Celular </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> Tampón de lisis SDS </td><td> Al norte del estado </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Equipo necesario </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

Axones en el sistema nervioso central (SNC) no se regeneran mientras que en el sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran de forma limitada después de la lesión (Teng et al., 2006). Se reconoce que los programas de transcripción esencial para crecimiento de las neuritas y axones se reactivan después de la lesión en el SNP (Makwana et al., 2005). Sin embargo las herramientas disponibles para analizar la regulación de genes neuronales in vivo son limitadas y desafíos. Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) ofrecen un sistema modelo excelente lesiones ya que tanto el SNC y SNP son inervadas por un axón bifurcado procedentes de la soma mismo. Los ganglios representan una colección discreta de cuerpos celulares en todos los eventos de la transcripción se producen, y proporcionar así una región claramente definida de la actividad transcripcional que puede ser fácilmente reproducible y retirado del animal. Lesiones de las fibras nerviosas en el SNP (nervio ciático, por ejemplo), donde la regeneración axonal ocurre, debe revelar una serie de programas de transcripción que son distintos de los que respondieron a una lesión similar en el sistema nervioso central, donde la regeneración no tiene lugar (por ejemplo, la médula espinal ). Sitios de unión factor de transcripción, histonas y la modificación del ADN resultante de una lesión a cualquiera SNP o sistema nervioso central puede caracterizarse utilizando inmunoprecipitación de cromatina (CHIP). Aquí se describe un protocolo de chip usando tejido fijado DRG ratón después de una lesión axonal. Esta poderosa combinación ofrece un medio para caracterizar el entorno de la cromatina a favor de la regeneración necesaria para promover la regeneración axonal.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enriquecimiento de cultivos de neuronas de ganglios de la raíz dorsal de ratones adultos mediante inmunopanización

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...