Name: detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00
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Este trabajo fue financiado por el NIH Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre subvención RO1 HL81248.

1. Cultivo de las células endoteliales aórticas bovinas (BAEC) <ol><li> Técnicas adecuadas de asepsia fueron seguidos. </li><li> En un baño de agua, medio caliente sin antibióticos a 37 ° C. </li></ol> Nota: El medio se compone de fenol libre Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) con 4,5 g / l de D-glucosa, 4 mM de L-glutamina, 1% sin aminoácidos esenciales, suplementado con fetal al 10% de suero bovino (FBS) y 2,5 mg / l de factor de crecimiento endotelial. <ol start=...

<ol>
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Atrapamiento EPR giro ha sido empleado en una amplia gama de aplicaciones biomédicas para la cuantificación y la identificación de los radicales libres. Atrapamiento Spin es altamente sensible, capaz de detectar los radicales en concentraciones que van desde nM a mM tanto por lo que es adecuado para aplicación en los sistemas biológicos. La formación del aducto paramagnético, NO-Fe 2 +-MGD, es la base de NO detección a través de EPR. Fe 2 +-MGD reacciona con rapidez NO 18</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Medio DMEM libre de fenol Alta glucosa en 1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminoácidos no esenciales </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de crecimiento endotelial </td><td> Millipore </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> ICa </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> A-23187 </td><td> Disolver en DMSO </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo Laboratories </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 215422-250G </td><td> Disolver en PBS con Ca y Mg </td></tr><tr><td> MGD </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> Disolver en PBS con Ca 2 + y Mg 2 + </td></tr><tr><td> Células BAEC </td><td> Sistemas de células </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS con CaCl 2 y MgCl 2 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol-miristato acetato (PMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 79346-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps

El nitrógeno reactivo / especies de oxígeno (ROS / RNS) a bajas concentraciones jugar un papel importante en la regulación de la función celular, de señalización, y la respuesta inmune, pero en concentraciones no regulados son perjudiciales para la viabilidad celular 1, 2. Mientras que los sistemas vivos han evolucionado con los mecanismos de defensa antioxidantes endógenos y la dieta para regular la generación de ROS, ROS se producen continuamente, como subproductos naturales del metabolismo normal del oxígeno y puede causar daño oxidativo a las biomoléculas que resultan en la pérdida de función de las proteínas, ADN división, o de los lípidos peroxidación de los tres, y en última instancia con el estrés oxidativo que conduce a la lesión celular o la muerte 4. Radical anión superóxido (O 2 • -) es el principal precursor de algunas de las especies más altamente oxidantes conocidos que existen en los sistemas biológicos, tales como peroxinitrito y el radical hidroxilo. La generación de O 2 • - señala el primer signo de ruptura oxidativa, y por lo tanto, ict detección y / o retención en los sistemas biológicos es importante. En esta demostración, O 2 • - fue generada a partir de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN). A través de la estimulación quimiotáctica con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), PMN genera O 2 • - a través de la activación de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa 5. El óxido nítrico (NO) sintasa, que se presenta en tres isoformas, como inducible, neuronal y NOS endotelial, o iNOS, nNOS o eNOS, respectivamente, cataliza la conversión de L-arginina a L-citrulina, utilizando NADPH para producir N º 6 . Aquí, NO generado a partir de células endoteliales. Bajo condiciones de estrés oxidativo, NOSe por ejemplo puede cambiar de la producción de NO a O 2 • - en un proceso llamado desacoplamiento, que se cree que está causada por la oxidación del grupo hemo 7 o el factor de co-, tetrahidrobiopterina (BH 4) 8. Hay sólo unos pocosmétodos fiables para la detección de radicales libres en los sistemas biológicos, pero están limitadas por la especificidad y sensibilidad. Atrapamiento centrifugado se utiliza comúnmente para la identificación de los radicales libres e implica la reacción de adición de un radical a una trampa de giro formando un aducto giro persistente que puede ser detectado por resonancia paramagnética electrónica (EPR), espectroscopía. Los aductos de varios radicales presentan espectro característico que puede ser utilizado para identificar a los radicales que se generan y pueden proporcionar una gran cantidad de información acerca de la naturaleza y la cinética de la producción de radicales 9. Los nitronas cíclicos, 5,5-dimetil-pirrolina-N-óxido, DMPO 10, la fosforil-sustituido DEPMPO 11, y el éster-sustituido, EMPO 12 y BMPO 13, han sido ampliamente empleado como atrapadores - el giro último trampas exhibe ya las vidas medias de O 2 • - aducto. Hierro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (MGD) 2 &lt;/&gt; Sub se utiliza comúnmente para atrapar NO debido a la alta tasa de formación de aducto y la alta estabilidad del aducto giro 14.

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Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Resonancia de electrones paramagnético (EPR), espectroscopía fue empleado para detectar óxido nítrico a partir de células endoteliales aórticas bovinas y aniones radicales superóxido de los neutrófilos humanos utilizando hierro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (mgd)<sub&gt; 2</sub&gt; Y 5,5-dimetil-1-pyroroline-N-óxido, DMPO, respectivamente.

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

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De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

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