Name: mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Este trabalho é apoiado por uma bolsa de RO1 NIH (NINDS).

1. Vírus Preparação para a injecção <ol><li> rAAVs foram comprados do fornecedor recomendado comercial, mas também podem ser produzidos em um laboratório do próprio (ver discussão abaixo). A solução vírus normalmente é produzido em um título de ~ 1x10 12 cópias do genoma por mililitro (GC / ml) e pode ser usado na titulação completa para manipular um grande número de células. Alternativamente, eles podem ser diluídas para produzir o nível desejado de rotulagem esparsas. Uma diluição a...

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

O método de injeção neonatal viral apresentado aqui fornece uma maneira simples e rápida de gerar em mosaicos vivo para o estudo do desenvolvimento do cérebro pós-natal. O método aproveita floxed alelos que estão atualmente disponíveis, bem como aqueles que estão sendo feitas através do Gene High Throughput Segmentação do projeto 6. Comparado ao uso da expressão transgênica de Cre, este método fornece uma maneira rápida de testar a função do gene em vários tipos celulares...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre, GFP-,-DsRed, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, ordem personalizada </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Bomba 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (Nenhuma porta pedal) </td></tr><tr><td> Retinal Pigment Kit Injeção Epitélio </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> RPE-KIT </td><td> Conjuntivo contém tubos agulhas, injeção (36G) e porta-agulha </td></tr><tr><td> NanoFil Seringa, 100μl </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Inclui agulha carregamento reutilizáveis </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo GFP </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo DsRed </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Bloco de aquecimento </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R do mouse </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Função normal do cérebro depende não só no desenvolvimento embrionário quando principais vias neuronais são estabelecidas, mas também sobre o desenvolvimento pós-natal quando os circuitos neurais são vencidas e refinado. Desregulação nesta fase pode levar a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, como autismo e esquizofrenia 1,2. Muitos genes foram estudados no cérebro pré-natal e encontrou crucial para muitos processos de desenvolvimento 3-5. No entanto, sua função no cérebro pós-natal é em grande parte desconhecida, em parte porque sua eliminação em ratos muitas vezes leva a letalidade durante o desenvolvimento neonatal, e em parte porque sua exigência no início do desenvolvimento dificulta a análise pós-natal. Para superar esses obstáculos, os alelos floxed desses genes estão sendo gerados em camundongos 6. Quando combinado com alelos transgênicos que expressam Cre recombinase em tipos específicos de células, eliminação condicional pode ser alcançado para estudar a função do gene no cérebro pós-natal. No entanto, este método requer alelos adicionais e tempo extra (3-6 meses) para gerar os ratos com genótipos adequados, limitando assim a expansão da análise genética para grande escala no cérebro do rato. Aqui nós demonstramos uma abordagem complementar que usa Cre virally-expresso para o estudo desses alelos floxed rápida e sistematicamente no desenvolvimento do cérebro pós-natal. Injetando recombinante vírus adeno-associado (rAAVs) 7,8 codificação Cre no cérebro neonatal, somos capazes de eliminar o gene de interesse em diferentes regiões do cérebro. Ao controlar o título viral e coexpressing um marcador da proteína fluorescente, que pode assegurar em simultâneo a inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsas. Este método ignora a exigência de muitos genes no início do desenvolvimento, e nos permite estudar a sua função de células autônomas em muitos processos críticos no desenvolvimento do cérebro pós-natal, incluindo o crescimento axonal e dendrítico, ramificação e azulejos, bem como a formação de sinapses e requinte. Este método tem sido utilizado com sucesso em nosso próprio laboratório (dados não publicados) e outros 8,9, e pode ser estendido a outros vírus, como lentivírus 9, bem como a expressão de shRNA ou dominante proteínas ativas 10. Além disso, ao combinar esta técnica com eletrofisiologia, bem como recém-desenvolvidas ferramentas de imagem óptico de 11, este método fornece uma nova estratégia para estudar como as vias genéticas influenciam o desenvolvimento do circuito neural e função em camundongos e ratos.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Método para testar a função do gene no cérebro pós-natal é descrito. AAVs recombinante expressando Cre e / ou uma proteína fluorescente são injetadas no cérebro de rato neonatal. Inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsos são alcançados, permitindo a análise rápida da função dos genes em processos críticos para o desenvolvimento do circuito neural.

Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Neurociência

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Estudando a função cerebral em crianças usando magnetoencefalografia

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Crônica implantação de matriz Electrocorticographic todo-cortical no sagui comum

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...