Name: induction and testing of hypoxia in cell culture
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture at JoVE.com

1. نقص الأكسجين الناجم عن حل كوكلي 2 كلوريد الكوبالت hexahydrate (II) (كوكلي 2 • 6H 2 O ، MW = 237.9) هو محفز الكيميائية للعامل 8 - 1.3 - نقص الأكسجين محرض. هذا المنتج هو قابل للذوبان في الماء (100 ملغ / مل) ، والرضوخ واضحة ، والحل الحمراء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 25mM في الماء المعقم د (إعداد مباشرة قبل الاستعمال) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كوكلي 2 في التركيز النهائي لل100μM الخاص في وسائل الإعلام العادية خلية ثقافة للحث على نقص الأكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كوكلي 2 الوسائط التي تحتوي على خلايا الجسم واحتضانها للثقافات 24hours في الحاضنة التقليدية (37 درجة مئوية ؛ C0 2 5 ٪). </li></ol> تركيز أعلاه يعمل لخطوط الخلية اختبرناها ولكن يجب اختبار كل سطر الخلية بتركيزات مختلفة (لإنشاء منحنى الجرعة) وكذلك في أوقات مختلفة في حضانة أجل الحد من سمية الدواء ذات الصلة وتحسين مقايسة. 2. نقص الأكسجين يتسبب في غرفة حاضنة وحدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ما لا يقل عن ثقافتين خلية متطابقة (الثقافة التوأم). يمكن أن يكون في مزارع الخلايا لوحات ، وقوارير أو أطباق الثقافة. لفتح غرفة ، وهما أولا فتح المشابك البلاستيكية البيضاء الواقعة على أنابيب موصولة إلى الغرفة (الأنابيب المستخدمة في الحقن / تطهير الغاز ميتة) وفتح بلطف حلقة المشبك الفولاذية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن المشبك. ويمكن الآن للغطاء والصواني يمكن إزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الثقافة في قاعة خلية ميتة. أيضا وضع طبق بتري تحتوي على الماء المعقم في الغرفة لتوفير الترطيب الكافي من الثقافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع &quot;التوأم&quot; ثقافة خلية في normoxia والسيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من الأدراج الخاصة بك المضمون وليس تتحرك ، ومن ثم إغلاق الغرفة مع غطاء لها. الموقف بشكل صحيح المشبك خاتم الفولاذ لضمان إغلاق سحري للغرفة وإغلاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلق نقص الأكسجين ، إرفاق أنابيب إلى &quot;نقص الأكسجة دبابات&quot; يحتوي على 1 ٪ خليط الغاز O 2. وإذا كان لديك متر تدفق متصلة دبابتك يكون متصلا مباشرة غرفة لها (الغاز تدفق دبابات متر غرفة). نستخدم متر مسجلة في تدفق منظم لدينا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن المهم لإزالة معظم إن لم يكن جميع الحاضرين الأوكسجين في الغرفة وسائل الاعلام الخاصة بك في أن تفعل ذلك بمسح الغرفة عن طريق فتح خزان الوقود بمعدل تدفق قدره 20 لترا لكل دقيقة لدقائق 70-10 ، ثم سرعان ما تتحول قبالة تدفق الغاز وأغلق تماما للغرفة عن طريق إغلاق كل من المشابك البيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الى غرفة الحاضنة التقليدية للفترة من الوقت المطلوب. إذا كنت تستخدم الثقافات الكبيرة ، السماح لوسائل الإعلام في الثقافات إلى التقليل من الغاز لمدة 1 -- 2 ساعة ثم كرر دافق. وتستند الخطوات المذكورة أعلاه على التوصيات منشئ &quot;(بيلوبس - روتنبرغ ، المؤتمر الوطني العراقي). تأكد من المضمون بشكل صحيح كنت خزان الغاز في كل وقت. </li></ol> ملاحظات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل القضاء على O 2 الواردة في وسائل الإعلام ينصح الغاز إعادة الغرفة مرة واحدة بعد 3hours - 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة أطول من فترة حضانة 48hours ينصح أيضا لإعادة غرفة الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومجسات الأكسجين (الأقطاب الكهربائية / مقياس ضغط الدم) التي تسمح للقياسات O 2 الواردة في الخلايا / الغرفة توفر مقياسا أدق ليا جواني / 2 تحتوي على غرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واستنبات الخلايا في الوقت أطوال مختلفة لجعل الوقت منحنى مساعدة في تحديد الوقت الأمثل للتعبير - 1α مؤسسة الحرمين في خلايا معينة. </li></ul> 3. تقييم نقص الأكسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مؤسسة الحرمين الكشف α - 1 التي لطخة غربية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة فتح الغرفة الخاصة بك كما هو موضح في القسم 2.2 والمكان على الفور الثقافات الخاصة بك على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز نقص الأكسجة الخلايا المعالجة وغير المعالجة ، مع حل SDS 5 ٪ في لوحات ثم نقل إلى خلية lyzate مواسير يصوتن ، spindown حطام خلية وجمع طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز البروتين باستخدام BCA عدة ، وإعداد نموذج بإضافة العازلة التحميل والتدفئة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات Electrophorese على هلام بولي أكريلاميد SDS - 8 ٪ ، ونقل إلى الأغشية النتروسليلوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الغشاء في برنامج تلفزيوني تحتوي على 5 ٪ من غير دسم الحليب الجاف و 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل على شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة ضد مؤسسة الحرمين ، وحيدة النسيلة 1α الابتدائية (1 / 600) في المنطقة العازلة نفسها طخة مناعية في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة ، 5min في كل مرة واحتضان مع HRP الثانوية الأضداد (1 / 2000) في برنامج تلفزيوني + 0.1 ٪ توين 20 لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة ، 5min الوقت /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طقم ECL بيرس وفيلم الأشعة السينية لإظهار الفرقة البروتين </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستجيبة العنصر نقص الأكسجة (HRE). مؤسسة الحرمين - 1α ينظم العديد من الجينات (أي VEGF ، EPO) ملزمة لتسلسل يسمى نقص الأكسجة العنصر تنظيم (HRE). تعليم حقوق الإنسان المرتبطة به الجين علامة طر هو ممكن للكشف عن نشاط مؤسسة الحرمين 9. لاستخدام هذا الأسلوب ، تحتاج أولا إلى الخلايا transfect الخاص مع البلازميد HRE - luciferase باستخدام أسلوب ترنسفكأيشن تكييفها لخلايا الجسم. على سبيل المثال كنا Lipofectamine 2000. الخلايا تحتاج إلى transfected لا يقل عن 4 ساعات قبل أن تكون المحتضنة في نقص الأكسجين وnormoxia. هذا الوقت يسمح للحمض النووي لدخول الخلايا بحيث لا تتأثر هذه الخطوة الأولى من نقص الأكسجين. يتم الكشف عن إشارة luciferase باستخدام أدوات الفحص Luciferase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخاص بتعليم حقوق الإنسان ، transfected الخلايا في نقص الأكسجين في الغرفة أو استخدام وحدات تعليم حقوق الإنسان ، transfected الخلايا المحتضنة مع كوكلي 2 ، تشمل السيطرة normoxia. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة المطلوب ، وإزالة الخلايا من النمو المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا في برنامج تلفزيوني ، إزالة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 400μl كاشف تحلل 1X في صحن الثقافة وتتخلص من الخلايا المرفقة ، ثم نقل منها إلى الأنبوب الصغير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الحطام بواسطة الطرد المركزي وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20μl مزيج من الخلايا lysates طاف مع 100μl من الكاشف Luciferase الفحص وقياس التألق باستخدام luminometer. </li></ol></li></ol> 4. ممثل النتائج : K562 في الخلايا (خلايا الإنسان خط اللوكيميا) مثقف 2 يوما في الأوكسجين منخفضة ، مقارنة normoxia ، نقص الأكسجة يدفع بزيادة قدرها مؤسسة الحرمين - 1α البروتين الذي اكتشفه لطخة غربية (الشكل 1). باستخدام HRE - 293 luciferase تعديل الخلايا (خلايا جنينية خط الكلى) المستزرعة في نقص الأكسجين ، وهي زيادة كبيرة ، مؤسسة الحرمين 1α النشاط تم الكشف عن خلايا ميتة في (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 : زيادة مؤسسة الحرمين ، في خلايا ميتة 1α. وكانت الثقافة في الخلايا K562 normoxia ونقص الأكسجة (الغرفة ميتة) لمدة 48 ساعة وتحليلها بواسطة لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة لمؤسسة الحرمين ، 1α. تم استخدام الأجسام المضادة لأكتين محددة لمراقبة التحميل. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> Figure2 : مؤسسة الحرمين - 1α النشاط. تعليم حقوق الإنسان ، وتعديل luciferase 293 مثقف ونقص الأكسجين في الخلايا لمدة 48 ساعة normoxia وlysed ثم لاكتشاف إشارة luciferase استخدام عدة ومقايسة luciferase luminometer ملف. يتم التعبير عن النتائج على النحو التلألؤ وحدة نسبية (RLU).

<ol>
	<li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer.">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li><li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer.">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li><li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix.">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1+and+human+disease:+one+highly+involved+factor.">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1:+master+regulator+of+O2+homeostasis.">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li><li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia:+importance+in+tumor+biology,+noninvasive+measurement+by+imaging,+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy.">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li><li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF+at+a+glance.">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li><li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoCl2,+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1,+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2.">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li><li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+(FOXO3a).">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء في ظروف نقص الأوكسجين تختلف كثيرا تبعا للأنواع الخلايا. لذا ، يجب عليك ضبط عدد الخلايا أو عدد من لوحات تبدأ مع الثقافات للتأكد من سيكون لديك ما يكفي من الخلايا / البروتينات لإجراء التجارب الخاصة بك. كلوريد الكوبالت الأسلوب له ميزة أن تكون غير مكلفة وسريعة. يحاكي هذا المنتج عن طريق حفز HIF-1/3α نقص الأكسجين ولكن يمكن أيضا تنظيم جينات أخرى ، تأكد من تكييف هذا المنتج إلى المشروع الخاص بك عن طريق التحقق من غيرها من الآثار ما كان يمكن أن يكون على وظيفة والنمط الظاهري للخلايا معينة ، بصرف النظر عن تقليد &quot; ميتة &quot;تأثير. دواء آخر يستخدم أيضا لنقص الأكسجين هو تقليد mesylate ديفيروكسامين (DFO ، الذي استخدم في تركيز 100 ميكرومتر النهائي). استخدام هذه العقاقير يسمح experimentator لفتح لوحة الثقافة / صحن / قارورة مرات عديدة دون أن يؤثر ذلك على &quot;حالة نقص الأوكسجين&quot;. لا يمكن للمستوى الأكسجين الموجود في خليط الغاز تختلف تبعا لتجاربك وأنواع الخلايا كقيم نقص الأكسجة تختلف تبعا لأنواع الأنسجة والخلايا. في الواقع ، بعض الخلايا هي ميتة في 5 ٪ O 2 الحاجة الأخرى أقل من 1 ٪ O 2 لتكون ميتة. يتم إضافة 5 ٪ CO 2 إلى خليط الغاز لتحقيق الاستقرار في الرقم الهيدروجيني للثقافات ، والنيتروجين عادة ما تبقى من الغاز. غرف ميتة لديها ميزة عدم استخدام العقاقير التي يمكن أن سلوك الخلية بشكل مستقل بديل للتوتر الأوكسجين. ومع ذلك ، يمكن القيام به ليست كل أنواع التجريب وإعادة الأوكسجين يدخل غرفة في كل افتتاح ويقلل بالتالي نقص الأكسجين. يجب عليك أن تنظر في هذا العامل تجاربك ؛ نقص الأكسجة / إعادة الأوكسجين هو شرط محدد يمكن أن تؤثر على بعض أنواع الخلايا. بديل لاستخدام محطات العمل نقص الأكسجة (متصلة خزانات الغاز قبل مختلطة أو لأنظمة الغاز الاختلاط) أو أكبر حاضنة نقص الأكسجة (نقص الأكسجة تجهيز الغرفة مع علبة القفازات) التي تسمح للتجريب وسائل الإعلام لتغيير والتلاعب في خلايا ميتة البيئة المستمر. وقد تم تسويقها غرف ميتة مختلفة على مدى العقد الماضي ، وينبغي أن يختار وفقا لاستخدام المختبر الخاص ، والمشاريع ، والفضاء ، والحجم ، والميزانية. ضمان الاستخدام الجيد دائما وحالة الغرفة الخاصة بك لضمان ظروف التربية الصحيحة. بشكل عام عند استخدام الغرفة ، يمكن أن يكون مستوى نقص الأكسجين عن طريق التضمين اختيار يمزج الغاز المختلفة (أي 1 ٪ ، 5 ٪ 10 ٪ أكسجين). فيما كشف 1α ، مؤسسة الحرمين ، فمن المهم أن نعرف أن بعض الخلايا السرطانية عن خط مؤسسة الحرمين في normoxia - 1α. ومن ثم فهي حاسمة لاستخدام normoxia مراقبة لتحديد المستوى القاعدي لمؤسسة الحرمين في هذه الأسطر الخلية. مؤسسة الحرمين ، ويمكن أيضا أن تكون 1α موجودة في normoxia في غير الخبيثة الخلايا التالية تحفيز الخلية أو الإجهاد. يمكن أن يحدث هذا أيضا إذا تجويع هذه الخلايا ، تأكد من أن يتم بشكل صحيح الثقافات صومعتك الأعلاف والمحافظة عليها.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> المناهضة للمؤسسة الحرمين - 1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> الكوبالت (II) كلوريد </td><td> سيغما </td><td> C8661 - 25G </td></tr><tr><td> غرفة الحاضنة </td><td> بيلوبس - روتنبرج </td><td> MIC - 101 </td></tr><tr><td> HRE - Luciferase البلازميد </td><td> Adgene </td><td> البلازميد 26731 </td></tr></tbody></table>

induction and testing of hypoxia in cell culture

يتم تعريف نقص الأكسجة بأنه انخفاض أو نقص الأكسجين في الأجهزة والأنسجة أو الخلايا. وهذا يمكن تخفيف حدة التوتر الأكسجين يكون راجعا إلى انخفاض حجم المعروض في الأكسجين (تشمل الأسباب غير كافية شبكة الأوعية الدموية ، خلل الأوعية الدموية ، وفقر الدم) أو إلى زيادة استهلاك الأكسجين النسبي لتوريد (الناجمة عن ارتفاع معدل الانتشار المفاجئ الخلية) . يمكن أن يكون نقص الأكسجين فيزيولوجية أو مرضية مثل سرطانات الصلبة 1-3 ، الخ التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين... كل الأنسجة والخلايا لديها القدرة على التكيف مع مختلف هذه الحالة الجديدة. أثناء نقص الأكسجين ، واستقرت نقص الأكسجين محرض ألفا عامل (مؤسسة الحرمين) ، وينظم جينات مختلفة مثل المتورطين في الأوعية الدموية أو نقل الأوكسجين 4. استقرار هذا البروتين هو السمة المميزة لنقص الأكسجين ، وكشف ذلك يستخدم بشكل روتيني للكشف عن مؤسسة الحرمين 5-7 نقص الأكسجة. في هذا المقال ، فإننا نقترح طريقتين بسيطة للحث على نقص الأكسجين في خلايا الثدييات الثقافات واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين في هذه الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture at JoVE.com

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

هنا نقترح أساليب بسيطة للحث على نقص الأكسجين في مزارع الخلايا واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين من الثقافات.

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

ثقافة العصبية الماوس السلائف الخلايا الجذعية

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of an antigen against which the immune system has been primed. The inflammatory reaction is characterized by redness and swelling of the site of antigenic challenge. It is a convenient model to determine the in vivo efficacy of immunosuppressants. Cutaneous DTH can be induced either by adoptive transfer of antigen-specific T lymphocytes or by active immunization with an antigen, and subsequent intradermal challenge with the antigen to induce the inflammatory reaction in a given skin area. DTH responses can be induced to various antigens, for example ovalbumin, tuberculin, tetanus toxoid, or keyhole limpet hemocyanin. Such reactions can also be induced against autoantigen, for example to myelin basic protein (MBP) in rats with experimental autoimmune encephalomyelitis induced with MBP, an animal model for multiple sclerosis (1).
Here we demonstrate how to induce an adoptive DTH reaction in Lewis rats. We will first stimulate ovalbumin-specific T cells in vitro and inject these activated cells intraperitoneally to naive rats. After allowing the cells to equilibrate in vivo for 2 days, we will challenge the rats with ovalbumin in the pinna of one ear, while the other ear wil receive saline. The inflammatory reaction will be visible 3-72 hours later and ear thickness will be measured as an indication of DTH severity.

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T (TEM) lymphocytes. Here we demonstrate how to activate antigen-specific TEM cells, induce adoptive DTH in Lewis rats and monitor the inflammatory response.

الاستقراء والرصد من فرط الحساسية المتأخرة نوع بالتبني في الفئران

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

أسلوب الثقافة شريحة لوبعد تطور الجراثيم الأسنان في يزدرع الثقافة

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

العزلة والثقافة، وزرع خلايا العضلات الأقمار الصناعية

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

بروتين ج-FOS كشف Immunohistological: أداة مفيدة كعلامة للممرات الوسطى تشارك في الاستجابات الفسيولوجية محددة<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; فيفو السابقين</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي<em&gt; في المختبر</em&gt; RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.