Name: induction and testing of hypoxia in cell culture
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00
Duration: 7 min 1 s
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1. CoCl 2 समाधान द्वारा प्रेरित Hypoxia कोबाल्ट (द्वितीय) क्लोराइड hexahydrate (2 CoCl • 6 2 हे, 237.9 मेगावाट =) hypoxia-inducible कारक 1.3 8 के एक रासायनिक inducer है. यह उत्पाद है (100 मिलीग्राम / एमएल) पानी में घुलनशील है, एक स्पष्ट, लाल समाधान उपज है. <ol><li> बाँझ dd पानी में एक 25mm शेयर समाधान तैयार करने के लिए, (उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार) </li><li> 100μM के अंतिम एकाग्रता में 2 CoCl अपने नियमित रूप से सेल संस्कृति मीडिया में hypoxia प्रेरित का उपयोग करें. </li><li> अपनी कोशिकाओं को CoCl 2 युक्त मीडिया जोड़ें और एक पारंपरिक इनक्यूबेटर में 24hours के लिए संस्कृतियों सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% C0 2) . </li></ol> ऊपर एकाग्रता सेल लाइनों हम परीक्षण किया है, लेकिन विभिन्न सांद्रता (करने के लिए एक खुराक पर निर्भर वक्र स्थापित) पर प्रत्येक कोशिका लाइन परीक्षण किया जाना चाहिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिन्न ऊष्मायन समय के क्रम में मादक पदार्थों से संबंधित विषाक्तता सीमा और परख अनुकूलन के लिए काम करता है. 2. मॉड्यूलर इनक्यूबेटर चैंबर में प्रेरित Hypoxia <ol><li> कम से कम दो (जुड़वां संस्कृति) समान सेल संस्कृतियों की तैयारी. सेल संस्कृतियों बोतल, प्लेटें, या संस्कृति बर्तन में हो सकता है. कक्ष खोलने के पहले दो सफेद प्लास्टिक चैम्बर (इंजेक्शन / hypoxic गैस purging के लिए इस्तेमाल किया ट्यूबों) और धीरे से इस्पात की अंगूठी दबाना खोलने जुड़ी ट्यूब पर स्थित clamps खुला. </li><li> क्लैंप रिलीज. ढक्कन और ट्रे अब हटाया जा सकता है. </li><li> Hypoxic कक्ष में सेल संस्कृति प्लेस. इसके अलावा एक पेट्री कक्ष में बाँझ पानी युक्त संस्कृतियों के पर्याप्त humidification प्रदान पकवान जगह है. </li><li> नियंत्रण के रूप में &quot;जुड़वां&quot; normoxia में सेल संस्कृति रखें. </li><li> सुनिश्चित करें कि आपके ट्रे और सुरक्षित नहीं चलती, और तब अपने ढक्कन के साथ चैम्बर बंद. सही ढंग से स्टील की अंगूठी दबाना स्थिति चैम्बर के hermetical बंद सुनिश्चित करने के लिए और इसे बंद. </li><li> Hypoxia बनाने के लिए, एक &quot;hypoxia टैंक&quot; के लिए ट्यूबिंग हे 1% 2 गैस मिश्रण युक्त देते हैं. यदि आप एक प्रवाह मीटर है अपने टैंक से जुड़े सीधे अपने कक्ष (गैस टैंक प्रवाह मीटर कक्ष) से ​​जोड़ा जाएगा. हम एक प्रवाह हमारे नियामक में शामिल मीटर का उपयोग करें. </li><li> यह महत्वपूर्ण है के लिए सबसे दूर अगर कक्ष में ऑक्सीजन और अपने मीडिया में उपस्थित नहीं, ऐसा करने के 7-10 मिनट के लिए 20 लीटर प्रति मिनट की एक प्रवाह दर पर गैस की टंकी को खोलने के द्वारा चैम्बर फ्लश, तो जल्दी से बंद गैस प्रवाह और पूरी तरह से दोनों सफेद clamps के समापन के द्वारा चैम्बर बंद. </li><li> एक पारंपरिक इनक्यूबेटर करने के लिए समय की अवधि के लिए वांछित कक्ष लौटें. यदि आप बड़े संस्कृतियों का उपयोग की अनुमति है, de-1 के लिए गैस संस्कृतियों में मीडिया - 2 घंटे और फिर फ्लश दोहराने. उपरोक्त कदम निर्माता सिफारिशों &#39;(Billups Rothenberg, इंक) पर आधारित हैं. सुनिश्चित करें कि आप गैस की टंकी ठीक सभी समय पर सुरक्षित हैं. </li></ol> नोट: <ul><li> आदेश में 2 हे तो इसे फिर से गैस करने की सलाह दी है 1-3hours बाद चैम्बर एक बार मीडिया में निहित को समाप्त करने के लिए . </li><li> ऊष्मायन 48hours की तुलना में लंबे समय के लिए यह भी फिर से गैस चैम्बर के लिए सलाह दी जाती है. </li><li> ऑक्सीजन सेंसर (इलेक्ट्रोड / नापने का यंत्र) है कि अनुमति देते हैं 2 हे माप कोशिकाओं / चैम्बर में निहित / intracellular कक्ष 2 हे होते हैं) का एक और अधिक सटीक माप प्रदान करेगा . </li><li> समय के विभिन्न लंबाई में संवर्धन कोशिकाओं के लिए एक समय वक्र बनाने के इष्टतम समय अपने विशेष कोशिकाओं में HIF-1α की अभिव्यक्ति का निर्धारण में मदद मिलेगी. </li></ul> 3. Hypoxia के मूल्यांकन <ol><li> HIF-1 पश्चिमी धब्बा के द्वारा α पता लगाने . <ol><li> अपने कक्ष फिर से खोलने के रूप में 2.2 खंड में वर्णित है और तुरंत बर्फ पर अपनी संस्कृतियों जगह. </li><li> 5% की प्लेटों में एसडीएस समाधान के साथ hypoxia इलाज और गैर इलाज कोशिकाओं lyse तो ट्यूबों के लिए सेल lyzate हस्तांतरण, sonicate, सेल मलबे spindown और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. </li><li> उपाय प्रोटीन एकाग्रता, बीसीए किट का उपयोग कर 5 मिनट के लिए लोड हो रहा है बफर और 95 में हीटिंग ° सी जोड़कर नमूना तैयार. </li><li> एक 8% जेल एसडीएस polyacrylamide और nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरण पर Electrophorese प्रोटीन. </li><li> कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस हिलनेवाला पर रात में पीबीएस में 5% गैर वसा शुष्क दूध झिल्ली युक्त और 0.1% बीच 20 ब्लॉक. </li><li> 4 में एक ही बफर में विरोधी HIF-1α प्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1 / 600) के साथ रात भर Immunoblot ° सी. </li><li> पीबीएस बीच 20 कमरे के तापमान, 5min हर बार और सेते में पीबीएस में एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी (1 / 2000) + 0.1% बीच 20 के लिए 45 मिनट के साथ 0.1% से युक्त में 3 बार धोएं. </li><li> पीबीएस 0.1% बीच 20 से युक्त कमरे के तापमान / 5min समय में 3 बार धोएं. </li><li> पियर्स ईसीएल किट का प्रयोग करें और एक्स - रे फिल्म प्रोटीन बैंड शो </li></ol></li><li> Hypoxia उत्तरदायी तत्व (HRE). HIF-1α एक दृश्य के लिए बाध्य बुलाया Hypoxia विनियमन तत्व (HRE) द्वारा कई जीन (यानी VEGF, ईपीओ) को नियंत्रित. मैं एक मार्कर जीन HRE से जुड़े का उपयोगटी संभव है HIF गतिविधि का पता लगाने के 9. इस विधि का उपयोग करने के लिए, पहले आप एक HRE-luciferase एक अभिकर्मक अपनी कोशिकाओं को अनुकूलित विधि का उपयोग प्लाज्मिड के साथ अपने कोशिकाओं transfect की जरूरत है. उदाहरण के लिए हम 2000 Lipofectamine इस्तेमाल किया. कक्ष के लिए कम से कम 4 घंटे ट्रांसफ़ेक्ट पहले hypoxia और normoxia में incubated की जरूरत है. इस बार डीएनए कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए इतना है कि इस दिशा में पहला कदम hypoxia से प्रभावित नहीं है की अनुमति देता है. luciferase संकेत luciferase परख किट का उपयोग कर पता चला है. <ol><li> Hypoxia में अपने HRE - ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं या मॉड्यूलर कक्ष में सेते HRE - ट्रांसफ़ेक्ट 2 CoCl साथ incubated कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए, एक normoxia नियंत्रण शामिल हैं. </li><li> वांछित ऊष्मायन अवधि के बाद, मध्यम विकास कोशिकाओं से हटा दें. </li><li> पीबीएस में कोशिकाओं कुल्ला, Pbs हटा दें. </li><li> संस्कृति डिश में 400μl 1X lysis अभिकर्मक बांटना और संलग्न कोशिकाओं परिमार्जन, तो उन्हें एक माइक्रो ट्यूब को हस्तांतरण. </li><li> संक्षिप्त centrifugation द्वारा गोली मलबे. </li><li> सेल के मिक्स 20μl luciferase परख अभिकर्मक के 100μl के साथ सतह पर तैरनेवाला lysates और उपाय एक luminometer का उपयोग luminescence. </li></ol></li></ol> 4. प्रतिनिधि परिणाम: K562 कोशिकाओं (मानव लेकिमिया सेल लाइन) में कम ऑक्सीजन में सभ्य 2 दिन normoxia की तुलना में, hypoxia के HIF-1α प्रोटीन है कि पश्चिमी धब्बा (चित्रा 1) के द्वारा पता लगाया गया था की वृद्धि लाती है. उपयोग HRE-luciferase 293 कोशिकाओं (भ्रूण गुर्दे सेल लाइन) संशोधित hypoxia में सुसंस्कृत, HIF-1α गतिविधि की वृद्धि महत्वपूर्ण hypoxic कोशिकाओं में पाया गया था (चित्रा 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="चित्रा 1"/> चित्रा 1: hypoxic कोशिकाओं में HIF-1α बढ़ाएँ. 48 घंटे के लिए K562 कोशिकाओं normoxia और hypoxia (hypoxic कक्ष) में संस्कृति और पश्चिमी धब्बा द्वारा HIF-1α के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग विश्लेषण. Actin के लिए एक एंटीबॉडी विशिष्ट लदान नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="चित्रा 2"/> Figure2: गतिविधि HIF-1α. HRE luciferase संशोधित 293 कोशिकाओं और 48 घंटे के लिए hypoxia के normoxia में सुसंस्कृत थे और तब luciferase luciferase परख किट और एक luminometer का उपयोग कर संकेत का पता लगाने lysed. परिणाम रिश्तेदार luminescence इकाई (RLU) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं.

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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

सेल और hypoxic परिस्थितियों में प्रसार व्यवहार्यता एक बहुत सेल प्रकार के आधार पर बदलती हैं. इसलिए, आप सेल नंबर या संस्कृतियों प्लेटें आप सुनिश्चित करें कि आप अपने प्रयोगों के लिए पर्याप्त कक्षों / प्रोटीन होगा बनाने के साथ शुरू की संख्या को समायोजित करना चाहिए. कोबाल्ट क्लोराइड विधि के लिए सस्ती और तेजी से लाभ है. यह उत्पाद है HIF-1/3α inducing द्वारा hypoxia mimics लेकिन भी अन्य जीन को नियंत्रित कर सकते हैं, यकीन है कि इस उत्पाद के अन्य क्या प्रभाव यह समारोह और अपने विशेष कोशिकाओं के फेनोटाइप पर &quot;नकल के स्वतंत्र रूप से हो सकता है की जाँच द्वारा अपनी परियोजना के लिए अनुकूलित है hypoxic प्रभाव &quot;. एक और भी hypoxia नकल के लिए इस्तेमाल दवा Deferoxamine mesylate (डीएफओ, 100 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता) है. इन दवाओं का उपयोग experimentator &quot;hypoxic हालत को प्रभावित किए बिना संस्कृति की थाली / फ्लास्क / पकवान कई बार खोलने के लिए अनुमति देता है. ऑक्सीजन गैस मिश्रण में निहित के स्तर अपने प्रयोगों और सेल प्रकार के आधार पर hypoxia के मूल्यों के रूप में ऊतकों और सेल प्रकार के आधार पर भिन्न भिन्न हो सकते हैं. दरअसल, कुछ कोशिकाओं को 5% में hypoxic हे 2 अन्य की जरूरत है कम से कम 1% 2 हे hypoxic जा रहे हैं. 5% सीओ 2 गैस मिश्रण करने के लिए जोड़ा जाता है संस्कृतियों के पीएच को स्थिर, गैस के बाकी आमतौर पर नाइट्रोजन है. Hypoxic कक्षों दवाओं है कि सेल व्यवहार ऑक्सीजन तनाव की स्वतंत्र वैकल्पिक कर सकते हैं का उपयोग नहीं करने का लाभ है. हालांकि, प्रयोग के सभी प्रकार के ऑक्सीजन के रूप में प्रत्येक खोलने पर कक्ष फिर से प्रवेश करती है और इस तरह hypoxia कम किया जा सकता है. आप अपने प्रयोगों में इस पहलू पर विचार करना चाहिए; / पुनः oxygenation hypoxia एक विशिष्ट शर्त है कि कुछ प्रकार की कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं. एक विकल्प के लिए hypoxia (पूर्व मिश्रित गैस टैंक या गैस मिश्रण प्रणाली के लिए जुड़ा) workstations या बड़ा hypoxia इनक्यूबेटर (दस्ताना बॉक्स के साथ hypoxia प्रसंस्करण चैम्बर) है कि प्रयोग मीडिया को बदलने के लिए और सतत hypoxic वातावरण में कोशिकाओं में हेरफेर की अनुमति देता का उपयोग करने के लिए है. विभिन्न hypoxic कक्षों पिछले एक दशक से अधिक commercialized है और अपने प्रयोगशाला, परियोजनाओं, अंतरिक्ष, आकार बजट, और प्रयोग किया जाता अनुसार चुना जाना चाहिए. हमेशा अच्छा है और अपने कक्ष के उपयोग की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए सही संस्कृति शर्तों की गारंटी है. सामान्य में एक कक्ष का उपयोग करते समय, hypoxia के स्तर पर विभिन्न गैस घोला जा सकता है (यानी 1%, 5% 10% ऑक्सीजन) का चयन करके modulated किया जा सकता. HIF-1α का पता लगाने के बारे में, यह जानना महत्वपूर्ण है कि कुछ कैंसर कोशिका लाइन normoxia में व्यक्त HIF-1α. इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए एक normoxia नियंत्रण का उपयोग करने के लिए इन सेल लाइनों में HIF के बेसल स्तर निर्धारित है. HIF-1α भी सेल उत्तेजना या तनाव के बाद गैर घातक कोशिकाओं में normoxia में मौजूद हो सकता है. यह भी अगर इन कोशिकाओं को भूखे हैं हो सकता है यकीन है कि अपने सेल संस्कृतियों ठीक और फ़ीड कर रहे हैं बनाए रखा.

<table border="1"><tbody><tr><th> अभिकर्मक के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th></tr><tr><td> विरोधी HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> कोबाल्ट क्लोराइड (द्वितीय) </td><td> सिग्मा </td><td> C8661-25g </td></tr><tr><td> इनक्यूबेटर चैंबर </td><td> Billups - Rothenberg </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> HRE-luciferase प्लाज्मिड </td><td> Adgene </td><td> 26731 प्लाज्मिड </td></tr></tbody></table>

induction and testing of hypoxia in cell culture

Hypoxia कमी या अंगों, ऊतकों, या कोशिकाओं में ऑक्सीजन की कमी के रूप में परिभाषित किया गया है. ऑक्सीजन तनाव की यह कमी ऑक्सीजन (कारण अपर्याप्त रक्त वाहिका नेटवर्क, दोषपूर्ण रक्त वाहिका, और एनीमिया शामिल हैं) में एक कम आपूर्ति या ऑक्सीजन की एक वृद्धि की खपत की आपूर्ति (अचानक उच्च सेल प्रसार की दर की वजह से) के सापेक्ष के लिए कारण हो सकता है है . Hypoxia शारीरिक या जैसे 1-3, रुमेटी गठिया, atherosclerosis, आदि के रूप में ठोस कैंसर में वैकृत हो ... प्रत्येक ऊतकों और कोशिकाओं को एक अलग क्षमता के लिए इस नई शर्त के लिए अनुकूल हो सकता है. Hypoxia के दौरान, hypoxia inducible कारक अल्फा (HIF) स्थिर है और angiogenesis या 4 ऑक्सीजन के परिवहन में शामिल लोगों के रूप में विभिन्न जीनों को नियंत्रित. इस प्रोटीन की स्थिरीकरण hypoxia की एक बानगी है, इसलिए का पता लगाने HIF नियमित hypoxia 5-7 के लिए स्क्रीन के लिए प्रयोग किया जाता है . इस अनुच्छेद में, हम दो सरल स्तनधारी सेल संस्कृतियों और सरल परीक्षणों में hypoxia प्रेरित करने के लिए इन कोशिकाओं की hypoxic स्थिति का मूल्यांकन तरीकों का प्रस्ताव है.

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Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

यहाँ हम सरल सेल संस्कृतियों और सरल परीक्षणों में hypoxia प्रेरित करने के लिए संस्कृतियों के hypoxic स्थिति का मूल्यांकन तरीकों का प्रस्ताव है.

प्रेरण और सेल संस्कृति में Hypoxia का परीक्षण

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

माउस तंत्रिका स्टेम सेल व्यापारियों की संस्कृति

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of an antigen against which the immune system has been primed. The inflammatory reaction is characterized by redness and swelling of the site of antigenic challenge. It is a convenient model to determine the in vivo efficacy of immunosuppressants. Cutaneous DTH can be induced either by adoptive transfer of antigen-specific T lymphocytes or by active immunization with an antigen, and subsequent intradermal challenge with the antigen to induce the inflammatory reaction in a given skin area. DTH responses can be induced to various antigens, for example ovalbumin, tuberculin, tetanus toxoid, or keyhole limpet hemocyanin. Such reactions can also be induced against autoantigen, for example to myelin basic protein (MBP) in rats with experimental autoimmune encephalomyelitis induced with MBP, an animal model for multiple sclerosis (1).
Here we demonstrate how to induce an adoptive DTH reaction in Lewis rats. We will first stimulate ovalbumin-specific T cells in vitro and inject these activated cells intraperitoneally to naive rats. After allowing the cells to equilibrate in vivo for 2 days, we will challenge the rats with ovalbumin in the pinna of one ear, while the other ear wil receive saline. The inflammatory reaction will be visible 3-72 hours later and ear thickness will be measured as an indication of DTH severity.

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T (TEM) lymphocytes. Here we demonstrate how to activate antigen-specific TEM cells, induce adoptive DTH in Lewis rats and monitor the inflammatory response.

प्रेरण और चूहों में दत्तक विलंबित प्रकार hypersensitivity की निगरानी

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव कार्डिएक व्यापारियों और cardiomyocytes के कुशल व्युत्पत्ति

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

अलगाव और चूहा यकृत कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Explant संस्कृति में दांत कीटाणुओं के विकास के बाद के लिए टुकड़ा संस्कृति विधि

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

स्नायु उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, और ट्रांसप्लांटेशन

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Hypoxia निम्नलिखित एकल कोशिका के स्तर पर ग्लोबल शाही सेना संश्लेषण का विश्लेषण

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

सी-FOS प्रोटीन Immunohistological जांच: एक उपयोगी उपकरण केंद्रीय रास्ते विशिष्ट शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल की एक मार्कर के रूप में<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; पूर्व विवो</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

द्वारा शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन का पता लगाने<em&gt; इन विट्रो</emवसाकोशिका संस्कृति में&gt; आरएनए पुल से नीचे

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.