Name: development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery at JoVE.com

אנו מודים בריטה Hoehn, Guihua Sun, האריס Soifer וליסה שרר לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות AI29329 ו HL07470 הוענק JJR ריאגנטים הבאים התקבלו באמצעות האיידס NIH מחקר מגיב תוכנית הפניה, אגף איידס, NIAID, NIH: CHO CHO-EE ו-gp160 תא קו; pNL4-3 לוק וקטור; HIV-1 באל gp120 מ DAIDS, NIAID.

1. הכנת הספרייה RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריית DNA החל הכיל 50 נוקלאוטידים של רצפים אקראיים היה מסונתז על ידי DNA משולב טכנולוגיות (Coralville, איווה). ה-DNA חד גדילי אוליגו רצף הספריה 5&#39;-GGG AGG ACG ATG CGG - N 50 - החטיבה ACG ACT CGC CCG - 3 &#39;(81 NT). האזור אקראי מוק?...

<ol>
	<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li><li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA.">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li><li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SELEX+primer.">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li><li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type,+secreted,+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein.">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li><li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses.">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li><li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection,+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells.">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li><li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology,+diagnostics,+and+therapy.">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li><li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+mediated+siRNA+delivery.">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li><li>McNamara, J. O., 2nd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras.">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li><li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors.">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li><li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers.">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li><li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy.">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li></ol>

Aptamers הן במבחנה התפתח חומצות גרעין להניח כי ספציפיים יציב צורות תלת ממדיות, ובכך לספק מאוד ספציפיות, וכפותים מולקולות ממוקדות 8. הזיקה נמוך מחייב nanomolar וספציפיות מעודן של aptamers אל המטרות שלהם להפוך אותם כלים תכליתי עבור אבחון, in vivo הדמיה ותרופות 9. ע...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> MF-Millipore קרום מסנן </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> גודל הנקבוביות 0.45 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Swinnex בעל מסנן </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> קוטר 13 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> QIAquick ג&#39;ל הפקת Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> דנ&quot;א לטיהור </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 טור </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA ריכוז </td></tr><tr><td> ביו ספין 30 טור </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA טיהור </td></tr><tr><td> תקי PCR DNA פולימראז </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 ערכת שעתוק </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP עבור ה-PCR </td><td> רוש </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה ריבונוקלאית, העברת E.coli </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> R1753 </td><td> tRNA מתחרה </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L gp120 חלבון </td><td> המחקר איידס מגיב תוכנית הפניה </td><td> 4961 </td><td> יעד חלבון </td></tr><tr><td> SiRNA משתיק ערכת תיוג - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה פנול / כלורופורם 01/05 פתרון (pH 4.5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> כלורופורם / Isopropanol 24 / 1 פתרון </td><td> סיגמא </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> עגל phosphatase מעיים (CIP) </td><td> ניו אינגלנד BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> קינאז polynucleotide T4 </td><td> ניו אינגלנד BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> רוש </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA משקעים </td></tr><tr><td> Gamma-32-P-ATP </td><td> MP ביו </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> אבחון הלאומי </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> אבחון הלאומי </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> חנקתי persulfate (APS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M5379-250 מ&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> RPMI מדיה 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון נתרן ביקרבונט, 7.5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני Essential Minimum (ממ) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> ממ שאינם חיוניים חומצת אמינו (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> ת&quot;א ערכה עם שיבוט PCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery

מגפה עולמית של זיהום על ידי HIV יצרה צורך דחוף כיתות חדשות של סוכנים תרופתי. היכולת חזק של קטן (SI) RNAs התערבות כדי לבלום את הביטוי של תעתיקי רנ&quot;א משלימים המנוצלת כמו סוג חדש של הרפוי עבור מגוון רחב של מחלות כולל איידס. דיווחים קודמים רבים הראו כי הרומן RNAi מבוסס anti-HIV/AIDS אסטרטגיות טיפוליות יש הבטחה רבה, עם זאת, מכשול מרכזי ליישום טיפולית מוצלחת תרגום הקליניים של siRNAs היא מסירה יעילה. במיוחד, בהתחשב הבטיחות והיעילות של RNAi מבוסס הרפוי, רצוי מאוד לפתח משלוח ממוקד תאיים siRNA הגישה אוכלוסיות תאים או רקמות ספציפיות. HIV-1 gp120 חלבון, מעטפה גליקופרוטאין על פני השטח של HIV-1, ממלא תפקיד חשוב בכניסה ויראלי לתאי CD4. האינטראקציה של gp120 ו CD4 שמפעיל HIV-1 כניסה יוזם היתוך תא יאומת כאסטרטגיה אנטי ויראלית רלוונטיות קלינית לגילוי סמים. בזאת, אנחנו קודם כל לדון הבחירה וזיהוי של 2&#39;-F שונה אנטי HIV aptamers gp120-RNA. בשיטה הקונבנציונלית nitrocellulose לסנן Selex, aptamers חדש מספר עם זיקה nanomolar בודדו מתוך 50 מקרי NT-RNA הספרייה. על מנת להשיג בהצלחה המינים קשורים עם זיקה גבוהה יותר, חומרא הבחירה נשלטת בקפידה על ידי התאמת התנאים. Aptamers שנבחרו במיוחד יכולים להיקשר ולהיות הפנימו במהירות לתוך תאים המבטאים את חלבון ה-HIV-1 המעטפה. בנוסף, aptamers לבדו יכול לנטרל HIV-1 infectivity. בהתבסס על aptamer מיטב A-1, יש לנו גם ליצור רומן כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה שבו הן aptamer ואת מנות siRNA יש עוצמה אנטי HIV פעילויות. יתר על כן, אנו מנצלים את gp120 aptamer-siRNA מפלצות למסירה התא סוג מסוים של siRNA לתוך HIV-1 תאים נגועים. זה תפקיד כפול הכימרה מראה פוטנציאל רב לשילוב שונים סוכני חומצות גרעין טיפולית (aptamer ו siRNA) ב-HIV-1 דיכוי, מה שהופך את aptamer-siRNA מפלצות מועמדים אטרקטיביים טיפולית לחולים באי טיפול תרופתי פעיל מאוד (HAART).

Watch this Scientific Journal Video about Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery at JoVE.com

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

מספר 2&#39;-Fluoro aptamers נגד HIV-RNA 1Ba-L gp120 עם זיקה nanomole מבודדים מספריית RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הליך Selex. חדש כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה נוצר מראה הבטחה רבה לטיפול אנטי HIV מערכתית.

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; ו אחר<em&gt; Vibrio</em&gt; מינים

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...