Name: development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery at JoVE.com

Мы благодарим Бритта Hoehn, Гуйхуа ВС, Харрис Сойфер и Лиза Шерер за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и AI29329 HL07470 присуждена JJR следующие реагенты были получены через NIH исследований СПИДа и Программа Ссылка реагентов, Отдел СПИДа, NIAID, NIH: СНО-EE и СНО-gp160 ячейки линии; pNL4-3 Люк вектор; ВИЧ-1 БЛ gp120 из DAIDS, NIAID.

1. Подготовка РНК библиотеку <ol><li> Начиная библиотеки ДНК содержит 50 нуклеотидов случайных последовательностей и был синтезирован Комплексная ДНК технологий (Coralville, штат Айова). Одноцепочечной ДНК олиго библиотеку последовательность 5&#39;-GGG AGG ACG ATG CGG - N 50 - CAG ACG ACT CGC CCG - 3 &quot;(81 п). Слу...

<ol>
	<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li><li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA.">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li><li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SELEX+primer.">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li><li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type,+secreted,+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein.">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li><li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses.">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li><li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection,+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells.">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li><li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology,+diagnostics,+and+therapy.">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li><li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+mediated+siRNA+delivery.">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li><li>McNamara, J. O., 2nd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras.">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li><li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors.">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li><li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers.">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li><li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy.">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li></ol>

Аптамеры в пробирке развивались нуклеиновых кислот, которые принимают конкретные и устойчивые трехмерные формы, тем самым обеспечивая высокую конкретные, жесткие привязки к целевой молекулы 8. Низкий наномолярных сродство и изысканные специфику аптамеры к цели сделать их ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> MF-Millipore мембранный фильтр </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Размер пор 0,45 мкм </td></tr><tr><td> Swinnex держатель фильтра </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> Диаметром 13 мм </td></tr><tr><td> QIAquick Гель Добыча Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> Очистки ДНК </td></tr><tr><td> Микроконтроллер YM-30 колонке </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> РНК концентрации </td></tr><tr><td> Био-спин 30 колонки </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> РНК очистки </td></tr><tr><td> Taq ПЦР ДНК-полимеразы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR системой </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 транскрипции Kit </td><td> Эпицентр </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> дНТФ для ПЦР </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Рибонуклеиновой кислоты, трансфер из E.coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> тРНК конкурента </td></tr><tr><td> ВИЧ-1-Ba-L gp120 белок </td><td> Исследования СПИДа и Программа Ссылка реагент </td><td> 4961 </td><td> Белка-мишени </td></tr><tr><td> Глушитель миРНК маркировке комплекта - Cy3 </td><td> Амбион </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Кислота фенол / хлороформ 5 / 1 раствора (рН 4,5) </td><td> Амбион </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Хлороформ / Изопропанол 24 / 1 решение </td><td> Сигма </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Теленок кишечной фосфатазы (CIP) </td><td> Новая Англия Биолаб </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> Т4 полинуклеотидкиназы </td><td> Новая Англия Биолаб </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Гликоген </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> РНК осадков </td></tr><tr><td> Гамма-P 32-ATP </td><td> Депутат биомедицинских </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> Национальный диагностики </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Национальный диагностики </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N-тетраметилэтилендиамина (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Аммоний персульфат (АПС) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine сульфоксимина </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 мг </td><td></td></tr><tr><td> RPMI СМИ 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Раствором бикарбоната натрия, 7,5% м / о </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Минимально необходимые Средняя (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM несущественные аминокислоты (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Т. А. Клонирование комплект с ПЦР 2,1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery

Глобальная эпидемия ВИЧ-инфекции создало насущную необходимость новых классов антиретровирусных препаратов. Мощные способности малых интерферирующих (SI) РНК для подавления экспрессии дополнительных транскриптов РНК в настоящее время используются в качестве нового класса терапевтических средств для целого ряда заболеваний, включая ВИЧ. Многие предыдущие отчеты показали, что роман RNAi основе Анти-ВИЧ/СПИД терапевтических стратегий широкие перспективы, однако основным препятствием для успешного терапевтического применения и клинических перевод siRNAs является эффективной доставки. Особенно, принимая во внимание безопасность и эффективность RNAi основе терапии, крайне желательно разработать целевые внутриклеточной доставки миРНК подход к конкретной популяции клеток или тканей. ВИЧ-1 gp120 протеин, гликопротеин конверт на поверхности ВИЧ-1, играет важную роль в вирусные вступления в клетки CD4. Взаимодействие gp120 и CD4, который вызывает ВИЧ-1, вход и инициирует слияние клеток была подтверждена как клинически значимые антивирусной стратегии для открытия новых лекарств. При этом, во-первых, мы обсудим выбор и идентификация 2&#39;-F изменение анти-ВИЧ gp120 аптамеров РНК. Использование обычных нитроцеллюлозных фильтров метод SELEX, несколько новых аптамеры с наномолярных близости были выделены из 50 случайных п РНК библиотеку. Для того чтобы успешно получить вид связан с более высоким сродством, выбор жесткости тщательно контролируется путем изменения условий. Выбранных аптамеры могут специфически связываться и быстро внутренним в клетках, экспрессирующих ВИЧ-1 конверт белка. Кроме того, аптамеры только могут нейтрализовать ВИЧ-1 инфекционности. Основываясь на лучших аптамер-1, мы также создаем новый двойной тормозной функции анти-gp120 аптамер-миРНК химеры, в которых оба аптамер и миРНК части обладают мощным анти-ВИЧ. Кроме того, мы используем gp120 аптамер-миРНК химер для камерного типа конкретной доставки миРНК в ВИЧ-1 инфицированных клеток. Эта двойная функция химера показывает значительный потенциал для объединения различных нуклеиновых кислот терапевтических агентов (аптамер и миРНК) для подавления инфекции ВИЧ-1, что делает аптамер-миРНК химеры привлекательной терапевтической кандидатов для пациентов отсутствии высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ).

Watch this Scientific Journal Video about Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery at JoVE.com

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Несколько 2&#39;-фтор РНК аптамеры против ВИЧ-1BA-L gp120 с наномоля близость изолированы от библиотеки РНК<em&gt; В пробирке</em&gt; SELEX процедуры. Новый двойной тормозной функции анти-gp120 аптамер-миРНК химера создается и показывает значительные предпосылки для системных анти-ВИЧ-терапии.

Развитие сотового типа конкретных анти-ВИЧ gp120 аптамеры для доставки миРНК

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Развитие Отрицательные Маркер для выбора Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Разработка IFN-γ ELISPOT Пробирной для оценки вирусом ветряной оспы конкретных клеточный иммунитет Вслед пуповинной крови трансплантации

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Mesenteric лимфатический проток канюлированного крысиной модели: Приложение к оценке кишечных лимфатической транспорта лекарства

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Во время миРНК Глушащий

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Развитие более чувствительным и специфичным хромогенного агаровой среде для обнаружения<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; И другие<em&gt; Vibrio</em&gt; Виды

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Разработка системы доставки Экономичный ДНК по «Acufection» и его применение к исследованию кожи

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Обнаружения диагностических Epitope Зика вирус

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Количественная ПЦР бактериофага Т7 от Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...