Name: preparation of quality inositol pyrophosphates
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates at JoVE.com

نشكر ألف ريشيو عن التعليقات المفيدة وقراءة المخطوط. وأيد هذا العمل عن طريق تمويل البحوث الطبية (MRC) المجلس إلى خلية علم الأحياء وحدة الإنسان من قبل برنامج منح العلوم الحدودي (RGP0048/2009-C).

1. رد الفعل الأنزيمية -- يوم 1 (1 ساعة بعد الظهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة الأولى هي إعداد 10-20 التفاعلات الإنزيمية المستقلة التي IP 6 K1 أو تحويل الملكية الفكرية VIP1 6 إلى الأشكال الإسوية pyrophosphorylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم له 6 - IP K1 والانزيمات GST - Vip1 تنقيته من E. القولونية وفقا لبروتوكول 17،18 الموصوفة سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50 ميكرولتر تحتوي على ردود فعل رد فعل 1X العازلة (Hepes 30 ملم 6.8 درجة الحموضة ، و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 6 مم MgSO 4 ، 1 ملم DTT) ، 6 فسفوكرياتين ملم (PCR) ، و 25 يو / مل CreatinePhosphoKinase (CPK) ، 5 مم ATP (ملغ الملح) ، 0.3 ملي IP6 ، 0،05-0،1 ميكروغرام صاحب IP - 6 K1 أو ضريبة السلع والخدمات Vip1. ضبط مستوى الصوت مع 2 MiliQ O. DDH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لفترة وجيزة في رد الفعل واحتضان 37 درجة مئوية خلال الليل مع التناوب. </li></ol> 2. بولي أكريلاميد صب جل والتحميل -- يوم 2 (4 ساعات بعد الظهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحضير هلام بولي أكريلاميد باستخدام 24 سم ، 18 سم لوحات زجاجية واسعة والفواصل واسعة 1.5 مم. وعادة ما يتم استخدام ممر 16 أو مشط التحضيرية حارة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج (50 مل / جل) يحتوي على ما يلي : 35.5 ٪ (W / V) الأكريلاميد : مكرر الأكريلاميد 19:01 ، 1X بيرسلفات الأمونيوم تريس / البورات / EDTA (TBE) ، 0.05 ٪ (W / V) (وكالة الأنباء الجزائرية ) ، Temed 0.05 ٪ (W / V). صب مزيج بين لوحات ما قبل محمل الزجاج ، وادخال المشط والسماح للتبلمر 30-60 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في هلام وبلمرة ، ونقل الجهاز إلى غرفة باردة وقبل تشغيله في TBE 1X لحوالي 30-60 دقيقة على 200-300 فولت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1X صبغة OrangeG (10 ملي تريس - pH7.0 حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم EDTA ، الجلسرين 30 ٪ ، 0.1 ٪ OrangeG) إلى كل التفاعل. تحضير عينة تحتوي على 2 nmol الملكية الفكرية 6 الى تحميل كعنصر تحكم القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا جيدا مع كل تشغيل العازلة باستخدام المحاقن والإبر 21G لإزالة أي يعجل ، ثم تحميل الجل. تجنب التحميل على الآبار الجانبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام بين عشية وضحاها على 450-550 فولت (7 mAmp / هلام) ، حتى الفرقة صبغ OrangeG ضمن مشاركة 10 سم من الجزء السفلي من هلام. </li></ol> 3. بمعزل عن الملكية الفكرية 7 -- يوم 3 (4 ساعات) ، ويوم 4 (6-7 عملية التجفيف SpeedVac ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك جهاز هلام بعناية وإزالة إحدى الصفائح الزجاجية ترك الجل على الآخر. قطع جزء صغير من الجل من فوق الشريط صبغ OrangeG إلى القاع الذي يحتوي على 6 من IP القياسية ومسار واحد العينة ، كما هو مبين في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على قطع جزء من هلام مع الأزرق طولويدين (0.1 ٪ (W / V) طولويدين الزرقاء ، و 20 ٪ (W / V) والميثانول ، 2 ٪ (W / V) الجلسرين) لبضع دقائق (1-3 دقائق) أو حتى الفرقة بيروفوسفات اينوزيتول تظهر. وضع لوحة من الزجاج الخلفي إزالة سابقا على رأس لمنع هلام هلام غير ملوثين من التجفيف. </li></ol> ينبغي أن الفرقة الملكية الفكرية 7 تكون مرئية منذ تشغيله بشكل أبطأ قليلا من مستوى 6 IP. وينبغي للاعبي التنس المحترفين ، والذي يعمل بشكل أسرع من 6 الملكية الفكرية ، وأيضا أن تكون مرئية (الشكل 1). نقل الجزء الملون من هلام في التوصل إلى حل لإزالة البقع (20 ٪ (W / V) الميثانول) لبضع دقائق ، يغسل أي فائض في الزرقاء وإعادة طولويدين الجل مع الجل غير ملوثين. إذا كان مطلوبا التصور العالي الأشكال الإسوية اينوزيتول pyrophosphorylated (IP IP 8 و 9) ، وصمة عار الجل مع الحل طولويدين تلطيخ الأزرق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، يغسل الأزرق طولويدين مع الحل دي تلطيخ لحوالي 15 دقيقة. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع خفض شفرة حلاقة الملكية الفكرية 7 الفرقة على الجزء غير ملوثين من هلام به كمرجع للملكية الفكرية موقف ترحيل 7 العزم مع الجل الملون (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الملكية الفكرية 7 الفرقة التي قطعت من الجل على أنبوب 15 مل و 10 مل من إضافة 2 MilliQ O. DDH وضع الأنابيب في التناوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. رفض السائل لإزالة الفائض من جزيئات الأكريلاميد TBE والمجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك ، نفذ two - جفاف الماء دورات. إضافة 5 مل من 50 ٪ (W / V) الميثانول إلى أنبوب مع هلام يحتوي على 7 الملكية الفكرية وتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. نقل شريحة هلام لأنبوب جديد 15 مل تحتوي على 5 مل من 2 MilliQ O DDH وتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. لا يتخلص من الميثانول وMilliQ H O 2 من الأنابيب. تكرار الجفاف دورة الماء مرة أخرى ، من خلال إعادة نقل هلام بولي أكريلاميد في 15 مل من الأنابيب المستخدمة سابقا. لا يمكن أن يؤديها واحد من يغسل طوال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيز IP eluted 7 ، جفاف 10 مل معا (5 مل MilliQddH 2 O و 5 مل 50 ٪ الميثانول (ث / ت)) باستخدام SpeedVac ساخنة عند 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة على عينات جافة تقريبا ، ونقل السائل المتبقي (300-600 ميكرولتر) لa1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وتدور لمدة 2 دقيقة في 5000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف جمع ونقل الى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي ؛ مغادرةأسفل 20-30 ميكرولتر أنها قد تحتوي على جزيئات الأكريلاميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك ضروريا الاستمرار في عملية التجفيف باستخدام SpeedVac غير مدفأة. وخفضت بشكل كبير في انتعاش IP 7 إذا العينات يجف تماما ، ثم إنهاء عملية التجفيف عندما تصل عينات حجم 100-300 ميكرولتر. </li></ol> 4. تحديد تركيز 7 الملكية الفكرية والنقاء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 2-5 ميكرولتر من العينة تعافى 7 IP لتشغيل على هلام PAGE ، على غرار الأقسام 2،2-2،5. تحميل العديد من التخفيفات IP 6 (أي 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 nmol) وفقا لمعايير وتركيز 4 nmol من بولي - P علامة. بعد تشغيل هلام ، تصور الأشكال الإسوية بيروفوسفات اينوزيتول بواسطة تلطيخ واجتثاث تلطيخ الجل كامل مع حل طولويدين الأزرق ، وبعد الإجراء الموضح في القسم 3.2 (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تلطيخ طولويدين ، يمكن تحديد التركيزات عن طريق مسح الجل ومقارنة الاختلافات في كثافة تتراوح بين 6 الملكية الفكرية والملكية الفكرية 7 ، وذلك باستخدام برامج التصوير مثل J - الصور ، كما هو مبين في الشكل 2B. </li></ol> 5. ممثل النتائج : ويمكن تحويل التحضيرية الأنزيمية للملكية الفكرية من 6 إلى 7 باستخدام IP IP 6 K1 وVIP1 الانزيمات حلها بسهولة باستخدام التحليل PAGE (الشكل 1). التحميل من 6 الملكية الفكرية باعتبارها التحكم في حجم جنبا إلى جنب مع تلوين طولويدين الجل الأزرق يتيح التعرف على المشتقات pyrophosphorylated ، حيث أنها تعمل بشكل أبطأ اعتمادا على عدد من المجموعات الفوسفات الموجودة على الحلبة اينوزيتول. الإجراء المذكورة أعلاه يسمح للتنقية سهلة من 7 IP. وكشف تحليل لبيروفوسفات اينوزيتول يطهر PAGE نقاء الملكية الفكرية لدينا 7 (الشكل 2A). ومن المثير للاهتمام ، و1/3PP-IP 5 ايزومير من الناتج 7 IP من VIP1 يهاجر أبطأ قليلا من أيزومر 5 5PP - IP من 7 IP التي تم إنشاؤها بواسطة K1 6 IP. 6 استخدام معايير الملكية الفكرية تسمح الكمي سهلة للتركيز IP المنقى 7 (الشكل 2B). 7 قبل استخدام الملكية الفكرية لمزيد من التجارب ، يمكن تقييم نشاطها البيولوجي (الشكل 3). 5PP - IP هو المحتضنة 5 مع VIP1 ومع الفوسفاتيز 7 IP DDP1 (diphosphoinositol phosphohydrolase متعددة الفوسفات). بشكل روتيني ، يتم تحويل الملكية الفكرية تنقيته من 7 إلى 8 من VIP1 الملكية الفكرية والملكية الفكرية التي DDP1 6 (الشكل 3). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" /> الشكل 1 : من تلطيخ طولويدين PAGE والعزلة من الفرقة الملكية الفكرية 7 قطع جزء من الجل الذي يحتوي على معيار (IP 6) والملون باستخدام حل طولويدين الأزرق. الفرق الثلاثة تمثل (من أعلى إلى أسفل) 7 IP ، IP 6 و ATP. ثم كان متحالفا الجزء الملون من هلام مع ما تبقى من هلام. هذا يسمح للتوطين جزء من هلام يحتوي على 7 الملكية الفكرية ، والتي يمكن بعد ذلك قص وتنقيته (مربع متقطع). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" /> الشكل 2 : تحليل PAGE الملكية الفكرية منتجات التفاعل 6 K1 وVIP1. أ) تم استخدام تحليل IP 6 (4 ، 2 ، 1 ، 0.5 nmol) عن طريق تلوين طولويدين الأزرق من أجل تحديد IP 7 تركيز تنقيتها من كل 6 IP K1 (IP - 5PP 5) وVIP1 (1/3PP-IP 5) ردود الفعل. B) مبعثر تحليل مؤامرة لتحديد تركيز الملكية الفكرية المنقى 7. وتم تحديد التركيزات وفقا لكثافة الموجات ، محسوبة باستخدام البرمجيات imageJ ، مقارنة كميات محددة مسبقا من 6 IP. والمحور السيني يمثل شدة ، ويمثل المحور Y - تركيزات التي أعرب عنها في nmol. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" /> الشكل 3 : تحليل النشاط 7 IP البيولوجي لتحديد نوعية الملكية الفكرية المنقى 7 المحتضنة نحن 5PP 5 - IP (IP 6 K1 IP ولدت 7) مع VIP1 أو مع الفوسفاتيز 7 DDP1 IP وحلها ثم رد الفعل على الصفحة. كشفت وتلطيخ دابي طولويدين الإنتاج المتوقع من 8 VIP1 الملكية الفكرية وتحويل الملكية الفكرية من 7 إلى 6 من DDP1 IP.

<ol>
	<li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+metabolism+and+signaling.">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li><li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules?.">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?.</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li><li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+structure,+enzymology+and+function.">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li><li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphosphoinositol+polyphosphates:+metabolic+messengers.">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li><li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases.">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li><li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups.">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li><li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate.">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li><li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases.">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li><li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells.">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li><li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases.">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li><li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length.">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li><li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns(3,4,5)P3+interactions.">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li><li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li><li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plc1p,+Arg82p,+and+Kcs1p,+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis,+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release.">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li><li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event.">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+(IP6K1).">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li><li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases.">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

غير محدودة بشدة استخدام بيروفوسفات اينوزيتول في الكيمياء الحيوية بسبب عدم توفر هذه المركبات التجارية وحساسية الفقيرة من طرق الكشف الحالية. مزيج من صفحة ، والذي تمكن من فصل الجزيئات التي تمتلك عدد مختلف من مجموعات الفوسفات ، وزرقة الطولويدين (الشكل 1) ، وصبغ متبدل اللون الذي يربط لمجموعات الفوسفات ، وتمكن من السهل اكتشاف الأشكال الإسوية pyrophoshate اينوزيتول فتح مجالات جديدة للبحث 20. نفذت استخدام التكنولوجيا PAGE وصف لتنقية المنتجات بيروفوسفات اينوزيتول رد الفعل الأنزيمية outby إما 6 أو IP K1 VIP1 هو بسيط ، طريقة اقتصادية والموثوق بها التي تسمح لإنتاج كميات كبيرة من الملكية الفكرية ذات جودة عالية 7. لا يقتصر على الطريقة الموصوفة أعلاه لعملية تنقية بسيطة للملكية الفكرية 7 ولكن تعديلات طفيفة على البروتوكول صفها قد تسمح لتنقية مجموعة مختلفة من pyrophosphates اينوزيتول. ويمكن الكشف عن أعلى فسفرته الأشكال الإسوية بيروفوسفات اينوزيتول ، تحتوي على مجموعة الفوسفات أكثر من ثمانية باستخدام الملكية الفكرية (7) أو كميات مختلفة من 6 الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 20،6. ويمكن الكشف عن هذه pyrophosphates اينوزيتول من خلال زيادة طول تلطيخ الداخلي وتنقيته في وقت لاحق (القسم 3.2). علاوة على ذلك ، فإن استخدام الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 5 للتفاعل الأنزيمي السماح للتنقية PP - IP (5) وpyrophosphates اينوزيتول أخرى تحتوي على مجموعة الهيدروكسيل على الحلقة اينوزيتول. في الختام ، وهذه الطريقة بسهولتها يسمح لتنقية موثوق بها كميات مليغرام من pyrophosphates اينوزيتول مع الأدوات المتاحة على نطاق واسع ، مما يفتح آفاقا جديدة لهذا الحقل البحوث المثيرة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> حمض الفيتيك (IP 6) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> بولي - P (فوسفات الصوديوم) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP ملغ الملح + 2 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> سيغما الدريخ </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> فسفوكرياتين (PCR) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho كيناز (CPK) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST - Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> له ، IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> له ، Ddp1 </td><td> المتوفرة في المختبر </td><td> المتوفرة في المختبر </td></tr><tr><td> الأكريلاميد : مكرر الأكريلاميد 19:01 (40 ٪) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> بيرسلفات الأمونيوم (APS) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> تريس / البورات / EDTA (TBE) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> تي 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> طولويدين الأزرق </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> المسيح </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> جل الأجهزة </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> فراغ مشعب </td><td> المسيح </td><td> ألفا 2-4 </td></tr><tr><td> فراغ مضخة </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

preparation of quality inositol pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates at JoVE.com

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

pyrophosphates اينوزيتول تلعب دورا هاما في أمراض السرطان مثل الإنسان ، والسكري والسمنة ، إلا أن الآلية الدقيقة لعمل هو موضع خلاف. عدم وجود pyrophosphates اينوزيتول المتاحة تجاريا يجعل دراسات تفصيلية للمشاكل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لإنتاج وعزل ملليغرام من pyrophosphates اينوزيتول.

إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

ميكروأرس] DNA : نموذج مراقبة الجودة ، وتهجين صفيف والمسح الضوئي

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين<em&gt; D. discoideum</em&gt; عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

أداة الويب لتوليد عالية الجودة آلة قابل للقراءة البيولوجية مسارات

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

جمع الحيوانات المنوية فرق الجودة باستخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

بروتوكول إزالة الميكروسيرس من الليزر الذي ينتج RNA عالي الجودة من عظام الماوس الطازجة المجمدة

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

التعرف الميداني على Chamomilla Matricaria باستخدام نظام qPCR المحمولة

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...