Name: preparation of quality inositol pyrophosphates
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates at JoVE.com

Wij danken A. Riccio voor nuttige opmerkingen en om het manuscript te lezen. Dit werk werd ondersteund door de Medical Research Council (MRC) financiering van de Cell Biology Unit en door een Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).

1. Enzymatische reactie - dag 1 (1 uur in de namiddag) <ol><li> De eerste stap is de voorbereiding van 10-20 onafhankelijke enzymatische reacties waarin IP-6 K1 of VIP1 IP-6 om te zetten in de pyrophosphorylated isovormen. </li><li> We maken gebruik van His-IP 6 K1 en GST-Vip1 enzymen gezuiverd van E. coli volgens het protocol eerder beschreven 17,18. </li><li> Bereid 50 pi reacties met 1X reactie buffer (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM creatinefosfaat (PCR), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg zout), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 ug His-IP 6 K1-of GST-Vip1. Het volume aanpassen met MiliQ DDH 2 O. </li><li> Kort draaien de reactie en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht met rotatie. </li></ol> 2. Polyacrylamide gel gieten en laden - dag 2 (4 uur in de middag) <ol><li> De polyacrylamide gel is opgesteld op basis van 24 cm lang, 18 cm breed glazen platen en 1,5 mm breed afstandhouders. Meestal een 16 rijstrook of een voorbereidende enkele rijstrook kam wordt gebruikt. </li><li> Maak een mix (50 ml / gel) met de volgende: 35,5% (w / v) Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1, 1X Tris / Boraat / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) ammoniumpersulfaat (APS ), 0,05% (w / v) TEMED. Giet de mix tussen de pre-gegoten glazen platen, plaatst u de kam en laat polymeriseren gedurende 30-60 minuten bij RT. </li><li> Nadat de gel is gepolymeriseerd, overdracht van de apparatuur aan de koude kamer en pre-run in 1x TBE voor ongeveer 30-60 minuten op 200-300 Volt. </li><li> Voeg 1X van OrangeG kleurstof (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glycerol, 0,1% OrangeG) naar elke reactie. Bereid een monster dat 2 nmol van IP-6 te laden als een standaard controle. </li><li> Was elke well grondig met stromend buffer met behulp van een injectiespuit en een 21G naald om een ​​neerslag te verwijderen, dan laadt u de gel. Vermijd het laden aan de zijkant putten. </li><li> Laat de gel &#39;s nachts op 450-550 Volt (7 MAMP / gel), tot de OrangeG kleurstof band is in de laatste 10 cm van de onderkant van de gel. </li></ol> 3. Isolatie van IP 7 - dag 3 (4 uur) en dag 4 (6-7 uur SpeedVac droogproces) <ol><li> Demonteer de gel apparaat en verwijder voorzichtig een glasplaat het verlaten van de gel op de andere. Snijd een klein deel van de gel van net boven de OrangeG kleurstof band tot op de bodem met het IP-6-norm en een monster baan, zoals weergegeven in figuur 1. </li><li> Vlekken op de afgesneden gedeelte van de gel met Toluidine Blue (0,1% (w / v) toluïdineblauw, 20% (w / v) methanol, 2% (w / v) glycerol) voor een paar minuten (1-3 min) of totdat de inositol pyrofosfaat band verschijnt. Leg de glazen plaat die eerder terug verwijderd op de top van de gel op de ongekleurde gel niet uitdroogt. </li></ol> Het IP-7 band zichtbaar moet zijn, omdat het draait iets trager dan het IP-6-norm. ATP, die loopt sneller dan de IP-6, moet ook zichtbaar zijn (Figuur 1). Breng de gekleurde deel van de gel in een de-kleuroplossing (20% (w / v) methanol) voor een paar minuten weg te wassen overtollige van Toluidine Blue en plaats de gel met de ongekleurd gel. Als visualisatie van hogere pyrophosphorylated inositol isovormen (IP-8 en IP-9) is vereist, vlekken op de gel met Toluidine Blue kleuroplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens wegspoelen van de Toluidine Blue met de de-kleuroplossing voor ongeveer 15 minuten. <ol start="3"><li> Met een scheermesje snijd de IP-7 band op de onbesmet gedeelte van de gel met als referentie het IP-7 migreren positie bepaald met de gekleurde gel (figuur 1). </li><li> Zet het IP-7 band die werd uit de gel gesneden op een 15 mL buis en voeg 10 ml MilliQ DDH 2 O. Zet buizen in rotatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de vloeistof te verwijderen overmaat van TBE en microscopische deeltjes acrylamide. </li><li> Vervolgens voeren twee uitdroging-hydratatie cycli. Voeg 5 ml van 50% (w / v) methanol op de buis met de gel met IP-7 en draaien bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Breng de gel slice naar een nieuwe 15 ml buis met 5 ml van MilliQ DDH 2 O en draai bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Gooi de methanol en MilliQ H 2 O uit de buizen. Herhaal de uitdroging-hydratatie cyclus nog een keer door opnieuw de overdracht van de polyacrylamide gel in de buizen van 15 ml eerder gebruikte. Een van de wassingen kan worden uitgevoerd &#39;s nachts. </li><li> Om zich te concentreren de geëlueerde IP-7, samen droog de ​​10 ml (5 ml MilliQddH 2 O en 5 ml 50% (w / v) methanol) met behulp van een SpeedVac verwarmd op 60 ° C. </li><li> Nadat de monsters zijn bijna droog, de overdracht van de resterende vloeistof (300-600 ul) om A1.5 ml centrifugebuis en spin gedurende 2 minuten bij 5000 tpm. </li><li> Verzamel supernatant en overbrengen naar een frisse 1,5 ml centrifugebuis; verlatende onderste 20 tot 30 pi, omdat het kan acrylamide deeltjes bevatten. </li><li> Indien nodig blijft het droogproces met behulp van een onverwarmde SpeedVac. Het herstel van IP-7 is drastisch verminderd indien de monsters helemaal droog is, dan beëindigen het droogproces wanneer de monsters bij de volume van 100-300 ul. </li></ol> 4. Bepaling van de IP-7 concentratie en zuiverheid. <ol><li> Gebruik 2-5 pi van de herstelde IP-7 monster om te draaien op een PAGE gel, vergelijkbaar met de artikelen 2.2-2.5. Plaats enkele verdunningen van IP-6 (dat wil zeggen 0,5, 1, 2, 4 nmol) als de concentratie standaard en 4 nmol van Poly-P marker. Na het uitvoeren van de gel, visualiseer de inositol pyrofosfaat isovormen door kleuring en de-kleuren van de hele gel met Toluidine Blue oplossing, volgens de procedure beschreven in paragraaf 3.2 (figuur 2A). </li><li> Na Toluidine kleuring, kunnen de concentraties worden bepaald door het scannen van de gel en het vergelijken van de verschillen in intensiteit tussen 6 IP en IP-7, met behulp van imaging-software zoals Image-J, zoals weergegeven in figuur 2B. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: De voorbereidende enzymatische omzetting van IP-6 naar 7 met behulp van IP-IP 6 K1 en VIP1 enzymen kan eenvoudig worden opgelost met behulp van PAGE-analyse (figuur 1). Het laden van IP-6 als een grootte van controle, samen met Toluidine Blue gel vlekken maakt de identificatie van de pyrophosphorylated derivaten, want ze draaien langzamer, afhankelijk van het aantal fosfaatgroepen aanwezig op de inositol ring. De hierboven beschreven procedure maakt het mogelijk eenvoudig zuivering van IP-7. De analyse van de gezuiverde inositol pyrofosfaat door PAGE onthulde de zuiverheid van onze IP-7 (Figuur 2A). Interessant is dat de 1/3PP-IP 5 isomeer van IP-7 product van VIP1 migreert iets trager dan de 5pp-IP 5 isomeer van IP-7 die wordt gegenereerd door de IP-6 K1. Het gebruik van IP-6-normen mogelijk te maken een eenvoudige kwantificering van de concentratie van de gezuiverde IP-7 (Figuur 2B). Voor het gebruik van IP-7 voor verdere experimenten, kan de biologische activiteit te worden beoordeeld (Figuur 3). 5pp-IP 5 is geïncubeerd met VIP1 en met de IP-7 fosfatase DDP1 (diphosphoinositol polyfosfaat phosphohydrolase). Routinematig wordt het gezuiverde IP-7 omgezet naar IP-8 door VIP1 en IP 6 door DDP1 (figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" /> Figuur 1:. Toluidine kleuring van PAGE en isolatie van de IP-7 band The gedeelte van de gel met de standaard (IP 6) werd gesneden en gekleurd met behulp van een Toluidine Blue oplossing. De drie bands vertegenwoordigen (van boven naar onder) 7 IP, IP 6 en ATP. Het gekleurde deel van de gel werd vervolgens uitgelijnd met de rest van de gel. Hierdoor kan de lokalisatie van het gedeelte van de gel met IP-7, die vervolgens kan worden gesneden en gezuiverd (gestippelde kader). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" /> Figuur 2: PAGE-analyse van IP-6 K1 en VIP1 reactieproducten. A) Analyse van de IP-6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) door Toluidine Blue kleuring was gebruikt om de IP-7 concentratie gezuiverd van zowel IP-6 K1 (5pp-IP 5) en VIP1 (1/3PP-IP te bepalen 5) reacties. B) Scatter plot analyse om de concentratie van de gezuiverde IP-7 te bepalen. Concentraties werden bepaald volgens band intensiteit, berekend met behulp van ImageJ software, ten opzichte van vooraf bepaalde hoeveelheden van IP-6. De X-as staat voor intensiteit, de Y-as staat de concentratie uitgedrukt in nmol. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" /> Figuur 3:. Analyse van IP zeven biologische activiteit Om de kwaliteit van het gezuiverde IP-7 bepalen we geïncubeerd 5pp-IP 5 (IP-6 K1 gegenereerd IP-7) met VIP1 of met de IP-7 fosfatase DDP1 en vervolgens opgelost de reactie op PAGE. De DAPI en Toluidine vlekken bleek de verwachte productie van IP-8 door VIP1 en de conversie van IP-7 om IP-6 door DDP1.

<ol>
	<li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+metabolism+and+signaling.">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li><li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules?.">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?.</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li><li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+structure,+enzymology+and+function.">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li><li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphosphoinositol+polyphosphates:+metabolic+messengers.">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li><li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases.">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li><li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups.">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li><li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate.">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li><li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases.">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li><li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells.">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li><li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases.">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li><li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length.">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li><li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns(3,4,5)P3+interactions.">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li><li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li><li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plc1p,+Arg82p,+and+Kcs1p,+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis,+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release.">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li><li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event.">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+(IP6K1).">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li><li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases.">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het gebruik van inositol pyrofosfaat in de biochemie wordt ernstig beperkt door de commerciële onbeschikbaarheid van dergelijke verbindingen en de slechte gevoeligheid van de bestaande detectiemethoden. De combinatie van pagina, die de scheiding van moleculen bezitten een verschillend aantal fosfaatgroepen, en Toluidine Blue (figuur 1), een metachromatische kleurstof die bindt aan fosfaat-groepen, maakt maakt het eenvoudig opsporen van inositol pyrophoshate isovormen het openen van nieuwe wegen van onderzoek 20. De beschreven gebruik van de PAGE-technologie om inositol pyrofosfaat producten van de enzymatische reactie te zuiveren uitgevoerd outby ofwel IP-6 K1 of VIP1 is een eenvoudige, economische en betrouwbare methode die het mogelijk maakt voor de productie van grote hoeveelheden van hoge kwaliteit IP-7. De hierboven beschreven methode is niet beperkt tot de eenvoudige zuivering van IP-7, maar kleine wijzigingen van de beschreven protocol kan de zuivering van een andere reeks van inositol pyro mogelijk te maken. Hogere gefosforyleerd inositol pyrofosfaat isovormen, met meer dan acht fosfaat groepen kunnen worden gedetecteerd met behulp van IP-7 of verschillende hoeveelheden van IP-6 als een substraat 20,6. Deze inositol pyrofosfaten kan worden gedetecteerd door het verhogen van de lengte van de kleuring procedure en vervolgens gezuiverd (paragraaf 3.2). Bovendien zou het gebruik van IP-5 als substraat voor de enzymatische reactie kan de zuivering van PP-IP 5 en andere inositol pyrofosfaten met een hydroxylgroep op de inositol ring. Kortom, deze niet veeleisend methode maakt het mogelijk om een ​​betrouwbare zuivering van milligram hoeveelheden van inositol pyro met wijd beschikbare instrumenten, waardoor het openen van nieuwe wegen voor dit spannende onderzoeksveld.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Fytinezuur (IP 6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (natriumhexametafosfaat) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + zout </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Creatinefosfaat (PCR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho Kinase (CPK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> His-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> His-Ddp1 </td><td> Verkrijgbaar in het lab </td><td> Verkrijgbaar in het lab </td></tr><tr><td> Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfaat (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Tris / Boraat / EDTA (TBE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Toluidine Blue </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Christus </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Gel apparatuur </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Vacuum spruitstuk </td><td> Christus </td><td> Alpha 2-4 </td></tr><tr><td> Vacuümpomp </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

preparation of quality inositol pyrophosphates

Myo-inositol is aanwezig in de natuur of ongewijzigde of in meer complexe gefosforyleerde derivaten. Van de nieuwste, de twee meest voorkomende in eukaryote cellen zijn inositol pentakisphosphate (IP 5) en inositol hexakisphosphate (fytinezuur of IP-6). IP en IP 5 6 zijn de voorlopers van inositol pyrofosfaat moleculen die een of meer pyrofosfaat obligaties 1 bevatten. Fosforylatie van IP 6 genereert diphoshoinositolpentakisphosphate (IP-7 of PP-IP 5) en bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 of (PP) 2-IP 4). Inositol pyrofosfaten zijn geïsoleerd van alle eukaryote organismen tot nu toe bestudeerd. Daarnaast zijn de twee verschillende klassen van enzymen die verantwoordelijk zijn voor de inositol pyrofosfaat synthese sterk geconserveerd doorheen de evolutie 2-4. Het IP-6 kinases (IP 6 KS) bezitten een enorme katalytische flexibiliteit, het omzetten van IP en IP 5 6 tot en met PP-IP en IP-4 7 respectievelijk vervolgens door het gebruik van deze producten als substraten, bevordering van het genereren van meer complexe moleculen 5,6 . Onlangs werd een tweede klasse van pyrofosfaat het genereren van enzymen die in de vorm van de gist-eiwit VIP-1 (ook wel aangeduid als PP-IP 5 K), die in staat is om IP-6 om te zetten in IP-7 en 8 IP 7,8. Inositol pyrofosfaten reguleren veel ongelijksoortige cellulaire processen zoals insuline secretie 9, de lengte van telomeren 10,11, chemotaxis 12, vesiculair transport 13, fosfaat homeostase 14 en HIV-1 gag los 15. Twee mechanismen van acties die zijn voorgesteld voor deze klasse van moleculen. Ze kunnen invloed hebben op cellulaire functie door allosterically interactie met specifieke eiwitten, zoals AKT 16. Als alternatief kan de pyrofosfaat groep kan een fosfaat doneren aan pre-gefosforyleerde eiwitten 17. Het enorme potentieel van dit onderzoek gebied wordt bemoeilijkt door het ontbreken van een commerciële bron van inositol pyrofosfaten, dat veel wetenschappers is het voorkomen van het bestuderen van deze moleculen en deze nieuwe post-translationele modificatie. De methoden die momenteel beschikbaar zijn inositol pyrofosfaten isoleren vereisen geavanceerde chromatografische apparatuur 18,19. Deze procedures gebruik van zure omstandigheden die kunnen leiden tot inositol pyrofosfaat degradatie 20 en dus tot een slechte herstel. Bovendien is de omslachtige post-column ontzouten procedures beperken het gebruik ervan aan gespecialiseerde laboratoria. In deze studie beschrijven we een weinig veeleisende methode voor het opwekken, isolatie en zuivering van de producten van de IP 6-kinase en PP-IP 5-kinases reacties. Deze methode was mogelijk door het vermogen van polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) op te lossen zeer gefosforyleerd inositol polyfosfaten 20. Volgende IP-6 K1 en PP-IP 5 K enzymatische reacties met behulp van IP-6 als de ondergrond, werd PAGE gebruikt om de gegenereerde inositol pyrofosfaten die vervolgens werden geëlueerd in water te scheiden.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates at JoVE.com

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Inositol pyrofosfaten spelen een belangrijke rol in de menselijke ziekten zoals kanker, diabetes en obesitas, maar het exacte werkingsmechanisme is een kwestie van geschil. Het gebrek aan commercieel beschikbare inositol pyrofosfaten maakt gedetailleerde studies problematisch. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het produceren en isoleren milligram inositol pyro.

De voorbereiding van Quality Inositol pyro

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

preparation-of-quality-inositol-pyrophosphates

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA Microarrays: Voorbeeld Quality Control, Array Hybridisatie en scannen

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological information. The pathways generated by this online application are machine-readable and fully compatible with essentially all web-browsers and computer operating systems. It uses a specially developed, web-enabled pathway drawing interface that permits the selection and placement of different combinations of pre-drawn biological or biochemical entities to depict reactions, interactions, transport processes and binding events. This palette of entities consists of chemical compounds, proteins, nucleic acids, cellular membranes, subcellular structures, tissues, and organs. All of the visual elements in it can be interactively adjusted and customized. Furthermore, because this tool is a web server, all pathways and pathway elements are publicly accessible. This kind of pathway &#34;crowd sourcing&#34; means that PathWhiz already contains a large and rapidly growing collection of previously drawn pathways and pathway elements. Here we describe a protocol for the quick and easy creation of new pathways and the alteration of existing pathways. To further facilitate pathway editing and creation, the tool contains replication and propagation functions. The replication function allows existing pathways to be used as templates to create or edit new pathways. The propagation function allows one to take an existing pathway and automatically propagate it across different species. Pathways created with this tool can be &#34;re-styled&#34; into different formats (KEGG-like or text-book like), colored with different backgrounds, exported to BioPAX, SBGN-ML, SBML, or PWML data exchange formats, and downloaded as PNG or SVG images. The pathways can easily be incorporated into online databases, integrated into presentations, posters or publications, or used exclusively for online visualization and exploration. This protocol has been successfully applied to generate over 2,000 pathway diagrams, which are now found in many online databases including HMDB, DrugBank, SMPDB, and ECMDB.

PathWhiz is a comprehensive, online pathway drawing tool for generating biochemical and biological pathways. It uses publicly accessible databases and easily expandable palettes consisting of pre-drawn pathway components. This protocol describes how to easily build new pathways, replicate and edit existing pathways, and propagate previously drawn pathways to different organisms.

Een Web tool voor het genereren van hoge kwaliteit Machine-leesbaar biologische pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Sperma collectie van differentiële kwaliteit met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological assessment and chemical analytical methods. However, the lack of availability of botanists, especially in recent years, coupled with the need to enhance quality control to combat the stresses on the supply chain brought by increasing consumer demand and climate change, necessitates alternative approaches. The goal of this protocol is to facilitate botanical species identification using a portable qPCR system on the field or in any setting, where access to laboratory equipment and expertise is limited. Target DNA is amplified using dye-based qPCR, with DNA extracted from botanical reference materials serving as a positive control. The target DNA is identified by its specific amplification and matching its melting peak against the positive control. A detailed description of the steps and parameters, from hands-on field sample collection, to DNA extraction, PCR amplification, followed by data interpretation, has been included to ensure that readers can replicate this protocol. The results produced align with traditional laboratory botanical identification methods. The protocol is easy to perform and cost-effective, enabling quality testing on raw materials as close to the point of origin of the supply chain as possible.

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Presented here is a protocol for field identification of Matricaria chamomilla using a portable qPCR system. This easy-to-perform protocol is ideal as a method to confirm the identity of a botanical species at locations where access to laboratory equipment and expertise is limited, such as farms and warehouses.

Veldidentificatie van Matricaria chamomilla met behulp van een draagbaar qPCR-systeem

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Een verbeterde chemotaxistest voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

The Cultivation, Growth, and Viability of Lactic Acid Bacteria: A Quality Control Perspective

Lactic acid bacteria (LAB) are essential dairy starter cultures that are significantly employed for the manufacture of fermented dairy products such as yogurt and cheese. LAB predominantly produce lactic acid as a major end product of fermentation, and they synthesize important metabolites that impart the organoleptic characteristics of fermented food products. LAB are fastidious bacteria that thrive in many environments when adequate nutritional requirements are fulfilled. The demand for superior LAB dairy starter cultures for fermentation applications in the food and dairy industry, has resulted in the need to provide viable and active cultures for all bioprocessing operations. The development of a standard protocol for ensuring the viability and enhanced functionality of LAB cultures in the laboratory as well as dairy processing environments is thus very critical. In addressing concerns linked to resuscitating weak, stressed, and injured LAB culture cells, a protocol that vividly outlines salient steps to recover, enhance cell regeneration, and improve metabolic functionality of LAB strains is of the utmost importance. The maintenance of culture purity, functionality, and viability for LAB starter cultures is likewise critical. Therefore, adherence to a unique protocol guideline will result in the promotion of fermentation performance for many LAB strains dedicated to fermentation and biotechnology processes. As a result, the Food Microbiology and Biotechnology Laboratory at North Carolina Agriculture and Technical State University has developed a standard protocol for the activation and quality control of selected LAB strains that has resulted in highly functional and viable LAB culture strains employed for fermentation research. The adaptation and recommendation of a protocol such as this for use in the dairy and food industry&#160;will help to ensure LAB viability and functionality for many applications.

The quality control assessment of lactic acid bacteria (LAB) cultures has been confirmed as an effective way to enhance the viability and functionality of LAB strains for fermentation procedures. To buttress this assertion, we developed a protocol that elucidates how LAB cultures are activated and cultivated for fermentation and bioprocessing procedures.

De teelt, groei en levensvatbaarheid van melkzuurbacteriën: een kwaliteitscontroleperspectief

Lactic acid bacteria (LAB) are essential dairy starter cultures that are significantly employed for the manufacture of fermented dairy products such as ...

Optimalisatie van de kwaliteit van gesproeidroogde probiotische producten door procesontwikkeling

Process Development for the Spray-Drying of Probiotic Bacteria and Evaluation of the Product Quality

Probiotics and prebiotics are of great interest to the food and pharmaceutical industries due to their health benefits. Probiotics are live bacteria that can confer beneficial effects on human and animal wellbeing, while prebiotics are types of nutrients that feed the beneficial gut bacteria. Powder probiotics have gained popularity due to the ease and practicality of their ingestion and incorporation into the diet as a food supplement. However, the drying process interferes with cell viability since high temperatures inactivate probiotic bacteria. In this context, this study aimed to present all the steps involved in the production and physicochemical characterization of a spray-dried probiotic and evaluate the influence of the protectants (simulated skim milk and inulin:maltodextrin association) and drying temperatures in increasing the powder yield and cell viability. The results showed that the simulated skim milk promoted higher probiotic viability at 80 &#176;C. With this protectant, the probiotic viability, moisture content, and water activity (Aw) reduce as long as the inlet temperature increases. The probiotics&#39; viability decreases conversely with the drying temperature.&#160;At temperatures close to 120 &#176;C, the dried probiotic showed viability around 90%, a moisture content of 4.6% w/w, and an Aw of 0.26; values adequate to guarantee product stability. In this context, spray-drying temperatures above 120 &#176;C are required to ensure the microbial cells&#39; viability and shelf-life in the powdered preparation and survival during food processing and storage.

Auteur Spotlight: Procesontwikkeling voor het sproeidrogen van probiotische bacteriën en evaluatie van de productkwaliteit  

This protocol details the steps involved in the production and physicochemical characterization of a spray-dried probiotic product.

Procesontwikkeling voor het sproeidrogen van probiotische bacteriën en evaluatie van de productkwaliteit

Probiotics and prebiotics are of great interest to the food and pharmaceutical industries due to their health benefits. Probiotics are live bacteria that ...