Name: preparation of quality inositol pyrophosphates
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
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Ringraziamo A. Riccio per gli utili commenti e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council (MRC) i finanziamenti per l&#39;Unità di Biologia Cellulare e da un Umano Frontier Science Grant Program (RGP0048/2009-C).

1. La reazione enzimatica - giorno 1 (1 ora al pomeriggio) <ol><li> Il primo passo è quello di preparare 10-20 indipendente reazioni enzimatiche in cui IP 6 K1 o VIP1 convertire IP 6 al isoforme pyrophosphorylated. </li><li> Utilizziamo His-IP 6 K1 e GST-VIP1 enzimi purificato da E. coli secondo il protocollo precedentemente descritto 17,18. </li><li> Preparare 50 reazioni microlitri contenente 1X tampone di reazione (30 Hepes mM pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatina (PCr), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg sale), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mg suo-IP 6 K1 o GST-VIP1. Regolare il volume con MiliQ DDH 2 O. </li><li> Brevemente girare la reazione e incubare a 37 ° C durante la notte con rotazione. </li></ol> 2. Poliacrilammide colata gel e di carico - giorno 2 (4 ore al pomeriggio) <ol><li> Il gel di poliacrilammide si prepara a 24 cm di lunghezza, lastre di vetro 18 centimetri di larghezza e 1,5 mm di larghezza distanziatori. Di solito un 16 lane o un singolo pettine corsia preparativo viene utilizzato. </li><li> Preparare una miscela (50 ml / gel) contenente le seguenti: 35,5% (w / v) di acrilammide: Bis-acrilamide 19:1, 1X Tris / Borato / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) di ammonio persolfato (APS ), 0,05% (w / v) TEMED. Versate il mix tra il pre-lastre di vetro fuso, inserire il pettine e lasciare polimerizzare per 30-60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Una volta che il gel è polimerizzato, trasferire l&#39;apparecchiatura alla stanza fredda e pre-run in TBE 1X per circa 30-60 minuti a 200-300 Volt. </li><li> Aggiungi 1X di OrangeG colorante (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glicerolo, 0,1 OrangeG%) per ogni reazione. Preparare un campione contenente 2 nmol di IP da 6 a caricare come un controllo standard. </li><li> Lavare ogni pozzetto a fondo con l&#39;esecuzione buffer utilizzando una siringa e un ago 21G per rimuovere l&#39;eventuale precipitato, quindi caricare il gel. Evitare di caricare nei pozzetti laterali. </li><li> Esegui il gel notte a 450-550 Volt (7 mAmp / gel), fino a quando la band colorante OrangeG è da meno di 10 cm dal fondo del gel. </li></ol> 3. Isolamento di IP 7 - giorno 3 (4 ore) e il 4 ° giorno (6-7 ore SpeedVac processo di essiccazione) <ol><li> Smontare l&#39;apparato gel e con attenzione rimuovere una lastra di vetro lasciando il gel su l&#39;altro. Tagliare una piccola porzione del gel da appena sopra la banda colorante OrangeG al fondo contenente l&#39;IP 6 standard e una corsia campione, come mostrato nella Figura 1. </li><li> Macchiare la parte tagliata del gel con blu di toluidina (0,1% (w / v) di blu di toluidina, 20% (w / v) metanolo, 2% (w / v) glicerolo) per alcuni minuti (1-3 min) o fino a quando la band pirofosfato inositolo appare. Mettere la lastra di vetro precedentemente rimosso torna in cima al gel per evitare che il gel senza macchia si secchi. </li></ol> L&#39;IP a 7 bande dovrebbero essere visibili in quanto corre leggermente più lento del IP 6 standard. ATP, che corre più veloce di IP 6, dovrebbero essere visibili (Figura 1). Trasferire la parte macchiata del gel in un de-soluzione colorante (20% (w / v) metanolo) per alcuni minuti, lavare via ogni eccesso di blu di toluidina e riposizionare il gel con il gel senza macchia. Se la visualizzazione di più isoforme pyrophosphorylated inositolo IP (IP 8 e 9) è richiesto, macchia il gel con una soluzione di toluidina colorazione blu per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare via il blu toluidina con la de-soluzione colorante per circa 15 minuti. <ol start="3"><li> Con una lametta tagliare la banda IP 7 sulla porzione senza macchia del gel utilizzando come riferimento la posizione di migrazione IP 7 determinato con il gel colorato (Figura 1). </li><li> Mettere la IP 7 band che è stata tagliata dal gel su un tubo da 15 ml e aggiungere 10 ml di MilliQ DDH 2 O. Mettere tubi in rotazione per 10 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il liquido per rimuovere l&#39;eccesso di particelle di acrilammide TBE e microscopiche. </li><li> Successivamente, eseguire due cicli di idratazione-disidratazione. Aggiungere 5 ml di 50% (w / v) metanolo al tubo con il gel contenente 7 IP e ruotare a temperatura ambiente per 2 ore. Trasferire la fetta gel a un nuovo tubo di 15 ml contenente 5 ml di MilliQ DDH 2 O e ruotare a temperatura ambiente per 2 ore. Non eliminare il metanolo e MilliQ H 2 O dai tubi. Ripetere la disidratazione-idratazione ciclo ancora una volta da ri-trasferimento del gel di poliacrilammide in provette da 15 ml precedentemente utilizzato. Uno dei lavaggi può essere eseguita durante la notte. </li><li> Per concentrare l&#39;IP eluiti 7, asciugare il 10 mL insieme (5 ml MilliQddH 2 O e 5 ml al 50% (w / v) metanolo) utilizzando un SpeedVac riscaldata a 60 ° C. </li><li> Una volta che i campioni sono quasi a secco, trasferire il liquido residuo (300-600 mL) a A1.5 tubo ml centrifuga e gira per 2 minuti a 5000 rpm. </li><li> Raccogliere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo di 1,5 ml per centrifuga; lasciareil fondo 20-30 microlitri dal momento che può contenere particelle di acrilammide. </li><li> Se necessario continuare il processo di essiccazione mediante un SpeedVac riscaldata. Il recupero di IP 7 è drasticamente ridotto, se i campioni asciugare completamente, quindi terminare il processo di essiccazione, quando i campioni di raggiungere il volume di 100-300 microlitri. </li></ol> 4. Determinazione della IP 7 concentrazione e purezza. <ol><li> Utilizzare 2-5 microlitri della recuperato IP 7 campioni per l&#39;esecuzione su un gel PAGE, in modo simile a Sezioni 2,2-2,5. Carico di diluizioni diverse di IP 6 (ovvero 0,5, 1, 2, 4 nmol) come standard la concentrazione e 4 nmol di Poly-P marcatore. Dopo aver eseguito il gel, visualizzare le isoforme pirofosfato inositolo dalla colorazione e de-colorazione il gel intero con una soluzione blu di toluidina, seguendo la procedura descritta al punto 3.2 (Figura 2A). </li><li> Dopo la colorazione toluidina, la concentrazione può essere determinata attraverso la scansione il gel e confrontando le differenze di intensità tra i 6 IP e IP 7, utilizzando software di imaging come immagine-J, come mostrato nella figura 2B. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La conversione preparativa enzimatica di IP da 6 a 7 utilizzando IP IP enzimi 6 K1 e VIP1 può essere facilmente risolto utilizzando l&#39;analisi PAGE (Figura 1). Il carico di 6 IP come controllare le dimensioni con colorazione blu toluidina gel permette l&#39;identificazione dei derivati ​​pyrophosphorylated, dal momento che corrono più lentamente a seconda del numero di gruppi fosfato presenti sull&#39;anello inositolo. La procedura descritta sopra permette la purificazione facile IP 7. L&#39;analisi del pirofosfato purificata da PAGE inositolo ha rivelato la purezza del nostro IP 7 (Figura 2A). È interessante notare che i 5 isomero 1/3PP-IP di IP 7 prodotti di VIP1 migra leggermente più lento del 5PP-IP 5 isomero di IP 7 che viene generato dal IP 6 K1. L&#39;uso di IP 6 standard consentire una facile quantificazione della concentrazione della IP purificato 7 (Figura 2B). Prima di utilizzare 7 IP per ulteriori esperimenti, la sua attività biologica può essere valutata (Figura 3). 5PP-IP 5 è incubato con VIP1 e con l&#39;IP 7 fosfatasi DDP1 (phosphohydrolase polifosfato diphosphoinositol). Di routine, l&#39;IP purificata 7 è convertito in IP 8 da VIP1 e IP 6 da DDP1 (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" /> Figura 1:. Colorazione di toluidina PAGE e isolamento della banda IP 7 La porzione del gel contenente lo standard IP (6) è stato tagliato e colorati con una soluzione di blu di toluidina. Le tre bande rappresentano (dall&#39;alto in basso) 7 IP, IP 6 e ATP. La parte macchiata del gel è stato quindi allineato con il restante del gel. Questo permette la localizzazione della porzione del gel contenente 7 IP, che possono poi essere tagliato e purificato (casella tratteggiata). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" /> Figura 2: analisi PAGE di IP prodotti di reazione 6 K1 e VIP1. A) Analisi di IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) dalla colorazione blu di toluidina è stato utilizzato per determinare la concentrazione IP 7 purificato da entrambe le 6 di IP K1 (5PP-IP 5) e VIP1 (1/3PP-IP 5) reazioni. B) appezzamento di analisi a dispersione per determinare la concentrazione di IP purificato 7. Le concentrazioni sono state determinate in funzione dell&#39;intensità delle bande, calcolato utilizzando il software ImageJ, rispetto ai livelli pre-determinata quantità di IP 6. L&#39;asse X rappresenta l&#39;intensità, l&#39;asse Y rappresenta concentrazioni espresse in nmol. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" /> Figura 3:. Analisi di IP 7 attività biologica Per determinare la qualità della PI purificata 7 abbiamo incubato 5PP-IP 5 (IP 6 K1 generato IP 7) con VIP1 o con l&#39;IP 7 fosfatasi DDP1 e poi risolto la reazione PAGINA. La colorazione DAPI e toluidina rivelato la produzione prevista di IP 8 da VIP1 e la conversione di IP da 7 a 6 per DDP1 IP.

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C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases.">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li><li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells.">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li><li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;uso di inositolo pirofosfato in biochimica è severamente limitato dalla indisponibilità commerciale di tali composti e la scarsa sensibilità dei metodi di rilevazione già esistenti. La combinazione di pagina, che consente la separazione di molecole in possesso di diverso numero di gruppi fosfato e blu di toluidina (Figura 1), un colorante metacromatica che si lega ai gruppi fosfato, consente la facile individuazione delle isoforme pyrophoshate inositolo aprendo nuove vie di ricerca 20. L&#39;uso della tecnologia descritta PAGE per purificare i prodotti pirofosfato inositolo della reazione enzimatica svolta outby sia IP 6 K1 o VIP1 è un metodo semplice, economico e affidabile che consente la produzione di grandi quantità di IP di alta qualità 7. Il metodo sopra descritto non si limita alla purificazione semplice IP 7, ma piccole modifiche del protocollo descritto può permettere la purificazione di una diversa gamma di pirofosfati inositolo. Superiore fosforilata isoforme pirofosfato inositolo, contenente più di otto gruppi fosfato possono essere rilevati tramite IP 7 o diverse quantità di IP 6 come substrato 20,6. Queste pirofosfati inositolo possono essere rilevati aumentando la lunghezza della procedura di colorazione e successivamente purificato (sezione 3.2). Inoltre, l&#39;uso di IP 5 come substrato per la reazione enzimatica che permette la purificazione di PP-IP 5 e altre pirofosfati inositolo contenente un gruppo idrossile sull&#39;anello inositolo. In conclusione, questo metodo permette di poco impegnativo per la purificazione affidabile di quantità milligrammo di pirofosfati inositolo con strumenti ampiamente disponibili, aprendo così nuove strade per questo campo di ricerca entusiasmante.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> L&#39;acido fitico (IP 6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (esametafosfato di sodio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + sale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Fosfocreatina (PCr) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho chinasi (CPK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-VIP1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Il suo-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Il suo-Ddp1 </td><td> Disponibile in laboratorio </td><td> Disponibile in laboratorio </td></tr><tr><td> Acrilamide: Bis-acrilamide 19:01 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Di ammonio persolfato (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Tris / Borato / EDTA (TBE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Blu toluidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Cristo </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Gel apparato </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Pressione di aspirazione </td><td> Cristo </td><td> Alfa 2-4 </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

preparation of quality inositol pyrophosphates

Myo-inositolo è presente in natura sia senza modifiche o più derivati ​​complessi fosforilata. Delle più recenti, il più abbondante nelle cellule eucariotiche due sono pentakisphosphate inositolo (IP 5) e hexakisphosphate inositolo (acido fitico o IP 6). IP 5 e IP 6 sono i precursori di molecole pirofosfato inositolo che contengono uno o più legami pirofosfato 1. Fosforilazione di IP 6 genera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 o PP-IP 5) e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 o (PP) 2-IP 4). Pirofosfati inositolo sono stati isolati da tutti gli organismi eucarioti sinora studiati. Inoltre, le due classi distinte di enzimi responsabili della sintesi pirofosfato inositolo sono altamente conservati durante l&#39;evoluzione 2-4. L&#39;IP 6 chinasi (IP 6 Ks) possiede una flessibilità enorme catalizzatore, la conversione IP 5 e 6 al PP IP-IP IP 4 e 7 rispettivamente e successivamente, utilizzando questi prodotti come substrati, promuovere la generazione di molecole più complesse 5,6 . Recentemente, una seconda classe di enzimi pirofosfato generazione è stata individuata nella forma della proteina di lievito VIP 1 (noto anche come PP-IP 5 K), che è in grado di convertire IP da 6 a 7 e IP IP 8 7,8. Pirofosfati inositolo regolano molti processi cellulari disparati quali la secrezione di insulina 9, la lunghezza dei telomeri 10,11, chemiotassi 12, il traffico vescicolare 13, 14 e omeostasi fosfato di HIV-1 gag rilascio 15. Due meccanismi di azione sono stati proposti per questa classe di molecole. Essi possono influenzare le funzioni cellulari da allosterically interagendo con proteine ​​specifiche, come AKT 16. In alternativa, il gruppo pirofosfato può donare un fosfato di pre-fosforilata proteine ​​17. L&#39;enorme potenziale di questo campo di ricerca è ostacolata dalla mancanza di una fonte commerciale di pirofosfati inositolo, che impedisce molti scienziati di studiare queste molecole e questa nuova modificazioni post-traduzionali. I metodi attualmente disponibili per isolare pirofosfati inositolo richiedono sofisticate apparecchiature cromatografiche 18,19. Queste procedure utilizzano condizioni di acidità che potrebbe portare al degrado pirofosfato inositolo 20 e quindi al recupero poveri. Inoltre, l&#39;ingombrante post-colonna procedure di dissalazione limitarne l&#39;uso a laboratori specializzati. In questo studio descriviamo un metodo poco impegnativo per la generazione, l&#39;isolamento e la purificazione dei prodotti di IP 6-chinasi e PP-IP 5-chinasi reazioni. Questo metodo è stato possibile grazie alla capacità di elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAG) per risolvere i polifosfati inositolo altamente fosforilata 20. A seguito di IP 6 K1 e PP-IP 5 K reazioni enzimatiche utilizzando IP 6 come il substrato, PAGINA è stato utilizzato per separare i pirofosfati generato inositolo che sono stati successivamente eluiti in acqua.

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Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Pirofosfati inositolo svolgono un ruolo importante nelle patologie umane come il cancro, il diabete e l&#39;obesità, ma l&#39;esatto meccanismo d&#39;azione è una questione di controversia. La mancanza di pirofosfati inositolo disponibili in commercio rende studi dettagliati problematico. Qui descriviamo un semplice protocollo per la produzione e isolare milligrammi di pirofosfati inositolo.

Preparazione di Qualità pirofosfati Inositolo

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

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ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

Uno strumento web per la generazione di alta qualità Machine-readable vie biologiche

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...