Name: preparation of quality inositol pyrophosphates
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates at JoVE.com

Мы благодарим А. Риччио за полезные комментарии и прочитать рукопись. Эта работа была поддержана Советом по медицинским исследованиям (MRC) финансирования в отдел клеточной биологии и по правам пограничной науки Программа Грант (RGP0048/2009-C).

1. Ферментативной реакции - день 1 (1 час в день) <ol><li> Первый шаг заключается в подготовке 10-20 независимых ферментативных реакций, в которых ИП 6 K1 или VIP1 преобразования IP 6 до pyrophosphorylated изоформ. </li><li> Мы используем его IP-6 К1 и GST-VIP1 ферментов, очищенный от E. палочки в соответствии с протоколом описано выше 17,18. </li><li> Подготовка 50 мкл реакции, содержащие 1X реакционного буфера (30 мМ Hepes рН 6,8, 50 мМ NaCl, 6 мМ MgSO 4, 1 мМ DTT), 6 мм фосфокреатина (ПЦР), 25 ед / мл CreatinePhosphoKinase (КФК), 5 мМ АТФ (Mg соли), 0,3 мМ IP6, 0,05-0,1 мкг Его-IP 6 K1 или GST-VIP1. Регулировка громкости с MiliQ DDH 2 O. </li><li> Кратко спина реакции и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи с вращением. </li></ol> 2. Полиакриламидном геле литья и погрузка - 2-й день (4 часа в день) <ol><li> Полиакриламидном геле подготовлен с использованием 24 см в длину, 18 см шириной пластин стекла и 1,5 мм шириной прокладки. Обычно 16 полосы или препаративной одной гребенкой переулок используется. </li><li> Подготовка смеси (50 мл / гель), содержащий следующие: 35,5% (м / о) акриламид: бис-акриламид 19:1, 1X Трис / Борат / EDTA (КЭ), 0,05% (м / о) персульфата аммония (APS ), 0,05% (м / о) Temed. Вылейте смесь предварительно литых стеклянных пластин, вставьте расческу и пусть полимеризоваться в течение 30-60 минут при комнатной температуре. </li><li> Как только гель полимеризуется, передачу аппарата для холодной комнате и предварительно запустить в 1X TBE около 30-60 минут при 200-300 вольт. </li><li> Добавить 1X из OrangeG красителя (10 мМ Трис-HCl pH7.0, 1 мМ ЭДТА, 30% глицерина, 0,1% OrangeG) для каждой реакции. Подготовка образцов, содержащих 2 нмоль ИП 6 для загрузки в качестве стандартного контроля. </li><li> Промыть каждую лунку тщательно проточной буфера с помощью шприца и иглы 21G, чтобы удалить осадок, а затем загрузить геля. Избегайте нагрузки на стороне скважин. </li><li> Выполнить геля в течение ночи при 450-550 Вольт (7 MAMP / гель), пока OrangeG группы красителя в течение последних 10 см от нижней части геля. </li></ol> 3. Выделение IP-7 - день 3 (4 часа) и 4-й день (6-7 часа SpeedVac процесса сушки) <ol><li> Разберите гель аппарата и аккуратно удалить одну стеклянную пластину оставив гель на другую. Cut небольшая часть геля от чуть выше OrangeG группы красителя на дно содержащие ИП 6 стандартных и один образец полосы, как показано на рисунке 1. </li><li> Пятно вырезать часть геля толуидиновым синим (0,1% (м / о) толуидиновым синим, 20% (м / о) метанола, 2% (вес / объем) глицерин) в течение нескольких минут (1-3 мин) или до инозитол группы пирофосфат появляется. Поместите стеклянную пластинку ранее удалили обратно поверх геля для предотвращения неокрашенных гель от высыхания. </li></ol> ИП 7 полоса должна быть видна, поскольку она работает немного медленнее, чем ИП 6 стандарта. АТФ, который работает быстрее, чем IP-6, также должны быть видны (рис. 1). Передача окрашенные части геля в де-красящим раствором (20% (м / о) метанол) в течение нескольких минут, смыть любое превышение толуидиновым синим и переместить гель с неокрашенными геля. Если визуализация выше pyrophosphorylated инозитол изоформ (IP-8 и IP-9) не требуется, пятно гель с Толуидин решение окрашивания синий в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем смыть толуидин синий с де-красящим раствором в течение приблизительно 15 минут. <ol start="3"><li> С лезвием бритвы вырезать IP 7-ми полосный на неокрашенных часть геля, используя в качестве ссылки ИП 7 миграции положение определяется с окрашенных гель (рис. 1). </li><li> Положите ИП 7 группа, которая была вырезана из геля на 15 мл трубки и добавить 10 мл MilliQ DDH 2 O. Положите труб в ротации в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите жидкость для удаления избытка КЭ и микроскопических частиц акриламида. </li><li> Впоследствии, выполняют две дегидратации-гидратации циклов. Добавьте 5 мл 50% (м / о) метанола в трубку с гелем, содержащим IP-7 и вращаются при комнатной температуре в течение 2 часов. Передача геля для новых 15 мл пробирку, содержащую 5 мл MilliQ DDH 2 O и вращаться при комнатной температуре в течение 2 часов. Не выбрасывайте метанола и MilliQ H 2 O из труб. Повторите дегидратации-гидратации цикл еще раз, повторно передачи полиакриламидном геле в 15 мл трубы использовались ранее. Один из моющие средства могут быть выполнены в течение ночи. </li><li> Чтобы сосредоточиться элюировали ИП 7, сухой 10 мл вместе (5 мл MilliQddH 2 O и 5 мл 50% (м / о) метанола) с использованием SpeedVac нагревают при 60 ° C. </li><li> Как только образцы почти сухая, передача оставшейся жидкости (300-600 мкл) к A1.5 мл центрифужную пробирку и спина в течение 2 минут при 5000 оборотах в минуту. </li><li> Сбор супернатант и передачи в свежем 1,5 мл центрифужную пробирку, оставьтенижняя 20-30 мкл, поскольку она может содержать акриламида частиц. </li><li> При необходимости продолжить процесс сушки использованием неотапливаемых SpeedVac. Восстановление ИП 7 значительно сокращается, если образцы полностью высохнуть, поэтому прекращать процесс сушки, когда образцы достигают объема 100-300 мкл. </li></ol> 4. Определение IP 7 концентрации и чистоты. <ol><li> Используйте 2-5 мкл восстановленного ИП 7 образца для работы на PAGE гель, как и в разделах 2.2-2.5. Загрузите несколько разведений ИП 6 (0,5 т., 1, 2, 4 нмоль) в стандартной концентрации и 4 нмоль Поли-Р маркером. После запуска гель, визуализировать инозитол изоформ пирофосфат окрашиванием и де-окрашивание весь гель с толуидиновым синим решение, согласно процедуре, описанной в разделе 3.2 (рис. 2А). </li><li> После Толуидин окрашивания, концентрация может быть определена путем сканирования геля и сравнение различий в интенсивности между IP-6 и IP-7 с помощью обработки изображений, такие как изображения-J, как показано на рисунке 2Б. </li></ol> 5. Представитель Результаты: Препаративного ферментативного превращения IP 6 до 7 с помощью IP-IP ферменты 6 К1 и VIP1 можно легко разрешить с помощью PAGE анализа (рис. 1). Загрузка IP-6, как размер контроля совместно с Толуидин окрашивания геля Синий позволяет идентифицировать pyrophosphorylated производные, так как они работают медленнее, в зависимости от количества фосфатных групп, присутствующих на инозитол кольцо. Процедура, описанная выше, позволяет легко очистки IP 7. Анализ очищенной инозитол пирофосфат за страницей показал чистоту нашего IP-7 (рис. 2а). Интересно, что 1/3PP-IP 5 изомер ИП 7 продуктом VIP1 мигрирует немного медленнее, чем 5PP-IP 5 изомер ИП 7, порожденный IP 6 К1. Использование IP 6 стандартов разрешения легко количественная концентрация очищенного IP-7 (рис. 2Б). Перед использованием IP-7 для дальнейших экспериментов, его биологическая активность может быть оценен (Рис. 3). 5PP-IP 5 инкубируют с VIP1 и с ИП 7 фосфатазы DDP1 (diphosphoinositol полифосфат phosphohydrolase). Регулярно, очищенный ИП 7 преобразуется в IP-8, VIP1 и ИП 6 по DDP1 (рис. 3). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Толуидин окрашивание СТРАНИЦА и выделение IP-7-ми полосный часть геля, содержащего стандартные (IP-6) был вырезан и окрашивали толуидин синий раствор. Три полосы представляют (сверху вниз) IP-7, ИП 6 и АТФ. Окрашенных часть геля затем выравнивается с остальными геля. Это позволяет локализация часть геля, содержащего IP-7, которые затем можно вырезать и очищенные (пунктирная коробка). <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" /> Рисунок 2: СТРАНИЦА анализ IP реакции 6 К1 и VIP1 продукции. ) Анализ IP-6 (4, 2, 1, 0,5 нмоль) по толуидиновым синим окрашивания был использован для того, чтобы определить IP 7 Концентрация очищенного от обоих ИП 6 К1 (5PP-IP 5) и VIP1 (1/3PP-IP 5) реакций. B) анализ Scatter заговор с целью определения концентрации очищенных IP 7. Концентрации определялись по интенсивности полосы, рассчитанной с использованием программного обеспечения ImageJ, по сравнению с заранее определенным количеством IP-6. X-ось представляет интенсивность, Y-ось представляет концентрации выражены в нмоль. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" /> Рисунок 3. Анализ ИП 7 биологическую активность Для определения качества очищенной ИП 7 мы инкубировали 5PP-IP 5 (ИП 6 К1 порожденных IP-7) с VIP1 или с ИП 7 фосфатазы DDP1, а затем решил реакция на странице. DAPI и Толуидин окрашивание показало, ожидается производство IP-8, VIP1 и преобразование IP-7 по IP-6, DDP1.

<ol>
	<li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+metabolism+and+signaling.">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li><li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules?.">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?.</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li><li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+structure,+enzymology+and+function.">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li><li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphosphoinositol+polyphosphates:+metabolic+messengers.">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li><li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases.">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li><li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups.">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li><li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate.">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li><li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases.">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li><li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells.">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li><li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases.">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li><li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length.">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li><li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns(3,4,5)P3+interactions.">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li><li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li><li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plc1p,+Arg82p,+and+Kcs1p,+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis,+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release.">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li><li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event.">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+(IP6K1).">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li><li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases.">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Использование инозитол пирофосфата в биохимии сильно ограничена коммерческой отсутствия таких соединений и низкой чувствительности существующих методов обнаружения. Сочетание PAGE, который позволяет разделение молекул, имеющих разное количество фосфатных групп, и толуидиновым синим (рис. 1), метахроматическая краситель, который связывается с фосфатными группами, позволяет легко обнаружения инозитол изоформ pyrophoshate открывая новые направления исследований 20. Описано использование технологии СТРАНИЦА, чтобы очистить инозитол продуктов пирофосфат ферментативной реакции осуществляется outby либо ИП 6 K1 или VIP1 это простой, экономичный и надежный метод, который позволяет для производства большого количества высоких IP качества 7. Описанный выше метод не ограничивается простой очистки IP-7, но незначительные изменения описанного протокола может позволить очистки различный диапазон инозитол пирофосфаты. Высшее фосфорилированных инозитол изоформ пирофосфат, содержащие более восьми фосфатные группы могут быть обнаружены с помощью IP-7 или различное количество IP-6 в качестве подложки 20,6. Эти инозитол пирофосфаты могут быть обнаружены путем увеличения длины Процедура окраски, а затем очищенный (раздел 3.2). Более того, использование IP-5 в качестве субстрата для ферментативной реакции позволит очистки PP-IP-5 и других инозитол пирофосфаты содержащие гидроксильные группы по инозитол кольцо. В заключение этого нетребовательного метод позволяет надежной очистки миллиграмм количествах инозитол пирофосфаты с широко доступных инструментов, тем самым открывая новые перспективы для этой захватывающей области исследований.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Фитиновой кислоты (IP-6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Поли-Р (гексаметафосфат натрия) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> АТФ-Mg 2 + соль </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Фосфокреатина (ПЦР) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho киназы (КФК) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-VIP1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Его-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Его-Ddp1 </td><td> Доступный в лаборатории </td><td> Доступный в лаборатории </td></tr><tr><td> Акриламид: бис-акриламид 19:1 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Персульфата аммония (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Трис / Борат / EDTA (КЭ) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Толуидиновым синим </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Христос </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Гель аппарата </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Вакуумный коллектор </td><td> Христос </td><td> Альфа 2-4 </td></tr><tr><td> Вакуум-насос </td><td> ПРО Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

preparation of quality inositol pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates at JoVE.com

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Инозитол пирофосфаты играют важную роль в человеческой патологии, такие рака, диабета и ожирения, однако точный механизм действия является предметом спора. Отсутствие коммерчески доступных инозитол пирофосфаты предоставляет детальные исследования проблематично. Здесь мы опишем простой протокол для производства и изолировать мг инозитол пирофосфаты.

Подготовка Качество Инозитол пирофосфаты

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

ДНК-микрочипов: Контроль качества образцов, Array Гибридизация и сканирования

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Неинвазивный метод отбора проб волос для получения высоких ДНК Качество от Неуловимый мелких млекопитающих

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

И что нельзя делать крио-электронной микроскопии: учебник по пробоподготовки и высокое качество сбора данных для высокомолекулярных 3D реконструкции

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Изучение белка качества системы управления<em&gt; D. discoideum</em&gt; Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

Веб-инструмент для создания высокого качества в машиночитаемой форме биологических путей

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

Коллекция спермы дифференциальной качества с использованием градиентного центрифугирования плотность

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Лазерный захват Microdissection Протокол, который дает высокое качество РНК из свежезамороженных костей мыши

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Полевая идентификация ромашки Matricaria с помощью портативной системы qPCR

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...