Name: immunohistochemistry: paraffin sections using the vectastain abc kit from vector labs
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00
Duration: 21 min 38 s
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<p class="jove_title">石蜡切片的染色</p><ol><li>脱蜡二甲苯（费舍尔X3的<sup>小号</sup> -4），每次5分钟3倍幻灯片每个月使用情况（变化二甲苯，二甲苯是有毒的） 。费舍尔文献08 - 812 - 1A和机架的20张幻灯片中使用的菜肴和涵盖，以适应这些菜。菜每200毫升液体。 </li><li>水合物通过酒精梯度如下（变化梯度，每2周）： <ul><li> 100％的乙醇（费舍尔＃A406 - 20）的2倍，每次2分钟</li><li>在95％的乙醇2倍，每次2分钟</li><li> 1X在70％乙醇为2分钟</li><li> 1X在50％乙醇2分钟</li><li> 1X在30％乙醇2分钟</li><li> 1X DDH <sub>2</sub> O为2分钟</li></ul></li><li>在DPBS浸泡5分钟（DPBS =贝科的修改后的磷酸盐缓冲生理盐水<sup>与Ca 2 +</sup>和<sup>Mg 2</sup> + ）。 </li></ol><p class="jove_title">抗原恢复： </p><ol><li>预热柠檬酸钠缓冲液（10毫米，pH值6.5）中的微波。 </li><li>库克在微波15分钟的幻灯片。幻灯片应永不干涸，所以检查每分钟，并添加柠檬酸钠必要时。 </li><li>在室温放凉。 </li><li>座内源性过氧化物酶的活性，用1％H <sub>2 O</sub> 2（1.5毫升30％的股票在20分钟DPBS适马50毫升DPBS的H - 1009） 。 </li><li>浸泡在DPBS 3 × 5分钟。 </li><li>座在4 ° C的DPBS + 5％的牛血清白蛋白（BSA）的0.1％钠叠氮化物+ 5％血清过夜孵育的非特定网站。 <em><br /></em> <br />注：血清抗体染色品种的选择将取决于。块的二次抗体（共轭生物素）是物种的血清。如果这是不可用，使用从一个物种的不同，是其中主要AB的血清。 <br /> <em><br /></em> </li><li>座生物素与亲和素/生物素阻断试剂盒（矢量实验室目录＃SP - 2001）网站： <ul><li>与亲和素ð孵育15分钟。 DPBS冲洗简要。 </li><li>孵育15分钟的生物素的解决方案。 </li></ul></li><li>在小学AB孵育2小时，在室温下，在DPBS + 2％BSA + NaAzide 0.1％+ 2％血清（作为阻塞步骤相同）。 </li><li>浸泡在PBS 3 × 5分钟。 </li><li>孵育二级AB为1小时，用生物素共轭室温在DPBS + 2％BSA + 0.1％叠氮钠+ 2％血清（阻塞步骤一样使用）。 </li><li>同时准备在ABC试剂，因为它已经开发使用前至少30分钟！ （见材料） </li><li>准备在50毫升的锥形管。在15毫升DPBS（无血清，无叠氮），添加试剂3滴，混合，并添加3滴试剂B和组合。避免挤压的瓶子，而等待的下降，形成自己的。 ABC试剂盒Vectastain PK - 6100从Vector实验室。 </li><li>浸泡在DPBS 3 × 5分钟。 </li><li>与ABC试剂孵育在室温为30-45分钟。 </li><li>浸泡在DPBS 3 × 5分钟。 </li><li>民建联过氧化物酶底物（矢量实验室＃SK - 4100）准备于5 ml DDH <sub>2 O</sub> <strong>使用前</strong>在一个玻璃小瓶（见材料） <ul><li>缓冲库存溶液2滴，混合</li><li>民建联4滴，混合（应成为淡棕色） </li><li> 2滴H <sub>2</sub> O <sub>2的</sub>混合</li></ul></li><li>拖放幻灯片上的民建联基板和观察为棕黄色染色。 </li><li>成冰浸幻灯片+自来水停止反应。 </li><li>冷的自来水下冲洗5分钟。 </li><li>苏木素复染液（20秒，费舍尔CS401 - D）和自来水冲洗，直到水出来。 </li><li>通过酒精梯度高达100％的乙醇（2分钟）在30％乙醇脱水。 </li><li>浸泡在二甲苯3 × 5分钟。 </li><li>山与Permount（费舍尔＃SP15 - 100）：把上述一些幻灯片上的部分慢慢地按到盖玻片部分无气泡。不要移动，直到完全干燥的盖玻片，约需24小时。 </li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>X3S-4</td>
<td>Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.</td>
</tr>
<tr>
<td>100% ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A406-20</td>
<td>Use to make EtOH gradient.</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Na-Citrate buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM, pH 6.5</td>
</tr>
<tr>
<td>H2O2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1009</td>
<td>30% stock => Dilute to 1% in DPBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. </td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NaAzide</td>
</tr>
<tr>
<td>avidin/biotin blocking kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector laboratories</td>
<td>SP-2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ab buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPBS + 2% BSA +  0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)</td>
</tr>
<tr>
<td>ABC kit Vectastain PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB peroxidase substrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SK-4100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ddH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hematoxylin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>CS401-D</td>
<td>counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Permount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SP15-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slides and cover-slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunohistochemistry: paraffin sections using the vectastain abc kit from vector labs

<p class="jove_content">免疫组织化学（IHC）是一个有价值的技术，利用本地化/可视化在安装组织部分使用特异性抗体蛋白表达。有两种方法：直接和间接的方法。在这个实验中，我们只描述使用间接免疫组化染色。间接免疫组化染色采用高度特异性的小学和中学生物素标记的抗体。主要是利用抗体绑定到特定的抗原表位，谨慎识别感兴趣的蛋白质，而二级抗体减去非特异性背景染色和放大，形成抗体复合物的主信号。幻灯片可以生成从冰冻切片，或石蜡包埋切片装在载玻片上。在这个协议中，我们讨论准备石蜡包埋切片，脱蜡，酒精梯度水化，热诱导的抗原修复，并阻断内源性过氧化物酶的活性和非特异性结合位点。部分路段，然后与CD8 + T细胞标记的特定抗体染色，有的则是酪氨酸羟化酶染色。随后与适当的结合，以生物素的抗体治疗的幻灯片，然后开发利用与Diaminiobenzidine（“民建联”）为底物的抗生物素蛋白结合的辣根过氧化物酶（HRP）。发展，幻灯片counterstained的对比，并根据与permount盖玻片上。充分干燥后，这些幻灯片，然后成像。</p>

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Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

免疫组化：石蜡切片从Vector实验室使用Vectastain ABC试剂盒

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