Name: immunohistochemistry: paraffin sections using the vectastain abc kit from vector labs
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00
Duration: 21 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs at JoVE.com

<p class="jove_title"> Färgning av paraffin </p><ol><li> Dewax diabilder med xylen (Fisher X3 <sup>S</sup> -4) 3x i 5 minuter vardera (ändra xylen varje månad beroende på användning, xylen GIFTIGT). Använd rätter och överdrag för 20 diabilder från Fisher ref 08-812-1A och rack för att passa dessa rätter. 200 ml vätska per maträtt. </li><li> Hydrate genom alkohol gradient enligt följande (ändra lutningen var 2 veckor): <ul><li> 2x i 100% etanol (Fisher # A406-20) i 2 minuter varje </li><li> 2x i 95% etanol i 2 min varje </li><li> 1x i 70% etanol i 2 min </li><li> 1x i 50% etanol i 2 min </li><li> 1x i 30% etanol i 2 min </li><li> 1x DDH <sub>2</sub> O i 2 min </li></ul></li><li> Blötlägg i DPBS i 5 min (DPBS = Dulbecco ändrade Fosfatbuffrad saltlösning med Ca <sup>2 +</sup> och Mg <sup>2 +).</sup> </li></ol><p class="jove_title"> Antigen återhämtning: </p><ol><li> Förvärmning av Na-citratbuffert (10 mM, pH 6,5) i mikrovågsugn. </li><li> Koka bilderna i 15 min i mikrovågsugnen. Bilderna bör aldrig torka så kolla varje minut och tillsätt Na-citrat vid behov. </li><li> Låt svalna i rumstemperatur. </li><li> Blockera endogen peroxidas-aktivitet med 1% H <sub>2</sub> O <sub>2</sub> i DPBS i 20 minuter (1,5 ml 30% lager Sigma H-1009 i 50 ml DPBS). </li><li> Blötlägg i DPBS 3 x 5 min. </li><li> Blockera icke-specifika webbplatser genom att inkubera över natten vid 4 ° C i DPBS + 5% bovint serumalbumin (BSA) + 0,1% Na Azid + 5% serum. <em><br /></em> <br /> Obs: Val av serum beror på arter där antikroppar används för färgning gjordes. Blockera med serum från de arter där den sekundära Ab (konjugerad till biotin) gjordes. Om detta inte är tillgängligt, använder serum från en annan art än den där de primära Ab gjordes. <br /> <em><br /></em> </li><li> Blockera biotin webbplatser med avidin / biotin blockering kit (Vector laboratorier katalog # SP-2001): <ul><li> Inkubera med Avidin D i 15 min. Skölj kort med DPBS. </li><li> Inkubera med biotin lösningen i 15 min. </li></ul></li><li> Inkubera i obearbetad Ab för 2 timmar i rumstemperatur, i DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% serum (samma som för blockering steg). </li><li> Blötlägg i PBS 3 x 5 min. </li><li> Inkubera med den sekundära Ab konjugerat med biotin i 1 timme i rumstemperatur i DPBS + 2% BSA + 0,1% Na Azid + 2% serum (samma som används för att blockera steget). </li><li> Förbered ABC reagens på samma gång eftersom det har att utvecklas i minst 30 min före användning! (Se Material) </li><li> Förbered i en 50 ml koniska rör. I 15 ml DPBS (inget serum, ingen azide) Tillsätt 3 droppar av reagens A, blanda och tillsätt 3 droppar reagens B och blanda. Undvik att klämma på flaskorna, i stället vänta på dropparna att bilda på egen hand. ABC kit Vectastain PK-6100 från Vector Labs. </li><li> Blötlägg i DPBS 3 x 5 min. </li><li> Inkubera med ABC reagens i 30-45 minuter i rumstemperatur. </li><li> Blötlägg i DPBS 3 x 5 min. </li><li> Förbered DAB peroxidas substrat (Vector Labs # SK-4100) i 5 ml DDH <sub>2</sub> O i en glasflaska <strong>omedelbart före användning</strong> (se Material) <ul><li> 2 droppar buffertlager lösning, blandning </li><li> 4 droppar DAB, mix (ska bli något brun) </li><li> 2 droppar H <sub>2</sub> O <sub>2,</sub> blanda </li></ul></li><li> Släpp DAB substrat ovanpå bilderna och titta på bruna fläckar. </li><li> Doppa objektglasen i is + kranvatten för att stoppa reaktionen. </li><li> Skölj under kallt kranvatten i 5 min. </li><li> Motfärga med hematoxylin (20 sek; Fisher CS401-D) och skölj i kranvatten tills vatten kommer ut klart. </li><li> Torka genom alkohol lutning från 30% etanol upp till 100% etanol (2 min vardera). </li><li> Blötlägg i xylen 3 x 5 min. </li><li> Montera med Permount (Fisher # SP15-100): sätta några ovan avsnittet om bilden och trycker sakta in på avsnitt med ett täckglas utan luftbubblor. Flytta inte täckglas tills helt torrt, vilket tar ~ 24 timmar. </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>X3S-4</td>
<td>Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.</td>
</tr>
<tr>
<td>100% ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A406-20</td>
<td>Use to make EtOH gradient.</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Na-Citrate buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM, pH 6.5</td>
</tr>
<tr>
<td>H2O2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1009</td>
<td>30% stock => Dilute to 1% in DPBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. </td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NaAzide</td>
</tr>
<tr>
<td>avidin/biotin blocking kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector laboratories</td>
<td>SP-2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ab buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPBS + 2% BSA +  0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)</td>
</tr>
<tr>
<td>ABC kit Vectastain PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB peroxidase substrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SK-4100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ddH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hematoxylin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>CS401-D</td>
<td>counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Permount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SP15-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slides and cover-slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunohistochemistry: paraffin sections using the vectastain abc kit from vector labs

<p class="jove_content">Immunohistokemi (IHC) är en värdefull teknik som används för att lokalisera / visualisera protein uttryck i en monterad vävnad avsnitt med hjälp av specifika antikroppar. Det finns två metoder: direkta och indirekta metoden. I detta experiment kommer vi att beskriva endast användningen av indirekta IHC färgning. Indirekt IHC färgning använder mycket specifika primära och biotin-konjugerade sekundära antikroppar. Primära antikroppar utnyttjas för att diskret identifiera proteiner av intresse genom att binda till en viss epitop, medan sekundära antikroppar subtrahera för icke-specifik bakgrundsfärgning och förstärka signalen genom att bilda komplex med den primära antikroppen. Diabilder kan antingen genereras från frysta snitt eller paraffininbäddad delar monterade på glas diabilder. I detta protokoll diskuterar vi utarbetandet av paraffininbäddade sektioner genom avvaxning, hydrering med hjälp av en alkohol gradient, värme-inducerad antigenåtervinning, och blockering av endogen peroxidas aktivitet och icke-specifika bindningsställen. Vissa delar är sedan färgas med antikroppar mot T-cell markör CD8 och medan andra färgas för tyrosin hydroxylas. Bilderna därefter behandlas med lämpliga sekundära antikroppar konjugerade till biotin, därefter utvecklat utnyttjar avidin-konjugerade pepparrotsperoxidas (HRP) med Diaminiobenzidine (DAB) som substrat. Efter utveckling är bilderna counterstained för kontrast, och monteras under täckglas med permount. Efter tillräcklig torkning, dessa bilder är sedan redo för avbildning.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs at JoVE.com

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistokemi: Paraffinsnitt Använda Vectastain ABC Kit från Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Purifying Plasmid DNA från kolonier Använda Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Anrikning av NK-celler från mänskligt blod med RosetteSep Kit från StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

RNA-extraktion från Neuroprecursor celler med Bio-Rad Totalt RNA Kit

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Immunohistokemi på Paraffinsnitt av Mouse Epidermis med fluorescerande antikroppar

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Snabb Genotypning av Mouse vävnad med hjälp av Sigmas Extrahera-N-Amp Tissue PCR kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of <em>Drosophila</em> Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av<em> Drosophila</em> Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mus Spermier Frysförvaring and Recovery med I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generering av Human inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod Använda STEMCCA lentivirusvektorn

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Detektering av modifierade former av cytosin Använda Sensitive Immunohistokemi

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

En Rapid Automatiserad Protokoll för Muscle Fiber Population Analysis i råttmuskel Cross sektioner med hjälp tunga kedjan från myosin Immunohistokemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...