Name: use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging
Uploaded: 2011-07-28T12:00:00
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Diese Arbeit wurde vom Massachusetts General Hospital Department of Medicine Internal Funds (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering gewähren T32EB006348 (CEC), Massachusetts General Hospital Center for Computational and Integrative Biology Fonds für die Entwicklung und AI062773 unterstützt ( RJH), Zuschüsse AI062773, DK83756 und DK 043351 (RJX), NSF 0643745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) und National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Wir danken Nicholas C. Yoder für hilfreiche Diskussionen und Charles Filze (RPI, Inc.) für die technische Unterstützung.

1. Kultur Bedingungen von Krankheitserregern für optische Fallen <ol><li> Wachsen A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) auf einem semi-Agar-Medien mit SBD (Sabouraud Dextrose) bei 30 ° C für 3 Tage. </li><li> Wachsen C. albicans (SC5314) in YPD (Hefe-Pepton Dextrose) Flüssigkultur mit 100 ug / ml Ampicillin über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung von Krankheitserregern für Fluoreszenzmarkierung <ol><li> Ernte gewünschten Betrag von Krank...

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	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. 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In dieser Arbeit verwenden wir einen optischen Falle auf Krankheitserreger mit Abmessungen zwischen 3 um einzufangen - 5 pm. Obwohl Krankheitserreger von Interesse für unser Labor in der Regel diese Dimensionen haben, ist die optische Pinzette hier beschriebene System flexibel auf eine Vielzahl von Größen Falle. In der Tat optische Fallen wurden verwendet, um Partikel von einzelnen Atomen, Zellen etwa 10 um im Durchmesser erfassen. Zusätzlich wurde diese optische Fallen System in der Lage, Partikel in verschiedenen ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Albino-Stamm, B-5233/RGD12-8, Geschenk von KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B-Mutante, Geschenk von Eleftherios Mylonakis, MGH, SC5314-Stamm, Geschenk von Gerald Fink, Whitehead Institute </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> ± 20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Frisches Blut </td><td></td><td></td><td> Gift aus RJW Heath, MGH, HMS </td></tr><tr><td> Nikon inversen Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Modell Ti-E </td></tr><tr><td> Trapping-Laser, ChromaLase </td><td> Blue Sky Research </td><td> CLAS-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Anregungs-Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td> Modell Innova 70C </td></tr><tr><td> Breadboards zum Einfangen von Komponenten </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Optische Lufttisch </td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektronischer Verschluss mit Pedal </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Gekauft von Vincent Associates, Rochester, NY </td></tr><tr><td> Singlemode Glasfaser </td><td> Oz Optics </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber Stellungsregler </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Faserkollimator </td><td> Oz Optics </td><td> HPUCO-23 bis 1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Objektive für Teleskop </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Brennweite von 150 mm </td></tr><tr><td> Übersetzung Stufen (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR dichroitischen Spiegel </td><td> Chroma </td><td> ET750-sp-2P8 </td><td></td></tr><tr><td> Objektiv (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1,49, Öl-Immersion, TIRF Ziel </td></tr><tr><td> Konfokale Kopf </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Polarizer </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Wollaston-Prisma </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Filterrad </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Filterrad </td><td> Sutter </td><td> LB10-NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered Deckglas </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Beschichtet mit anti-CD3 </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Dynamische Live Cell Imaging ermöglicht die direkte Visualisierung von Echtzeit-Interaktionen zwischen den Zellen des Immunsystems 1, 2, aber der Mangel an räumlicher und zeitlicher Steuerung zwischen den Fresszellen und Mikroben geleistet hat Beobachtungen in den ersten Interaktionen von Wirt Reaktion auf Krankheitserreger konzentrieren schwierig. Historisch gesehen haben interzellulären Kontakt Veranstaltungen wie Phagozytose 3 durch Mischen von zwei Zelltypen abgebildet worden, und dann kontinuierlich Scannen der field-of-view, um serendipitous interzellulären Kontakte auf der entsprechenden Stufe der Interaktion zu finden. Die stochastische Natur dieser Ereignisse macht dieses Verfahren langwierig, und es ist schwer zu früh oder flüchtige Ereignisse in Zell-Zell-Kontakt durch diesen Ansatz zu beobachten. Diese Methode erfordert finden Zellpaaren, dass am Rande der Kontakt sind, und beobachtet sie, bis sie vollendet ihre Kontaktdaten, oder nicht. Um diese Einschränkungen nutzen wir optische Fallen als nicht-invasive, nicht-destruktive, sondern eine schnelle und effektive Methode, um Zellen in Kultur positionieren. Optische Fallen oder optische Pinzette, sind zunehmend in der biologischen Forschung eingesetzt, um zu erfassen und physisch zu manipulieren Zellen und anderen Mikrometergröße Teilchen in drei Dimensionen 4. Strahlungsdruck wurde zum ersten Mal beobachtet und auf optische Pinzette-Systeme in 1970 5, 6, und wurde zum ersten Mal verwendet werden, um biologische Proben im Jahr 1987 7 zu steuern. Seither haben optische Pinzette in eine Technologie ausgereift, um eine Vielzahl biologischer Phänomene 8-13 Sonde. Wir beschreiben eine Methode, 14, die Fortschritte Live Cell Imaging durch die Integration einer optischen Falle mit Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf exquisite räumliche und zeitliche Steuerung von pathogenen Organismen in einer physiologischen Umgebung bieten, um Wechselwirkungen mit Wirtszellen, wie die ermittelten erleichtern Betreiber. Live, wurden pathogene Organismen wie Candida albicans und Aspergillus fumigatus, die tödlich enden, invasive Infektionen bei immungeschwächten Personen 15, 16 (z. B. AIDS, Chemotherapie und Organtransplantation Patienten) kann dazu führen, optisch gefangen mit zerstörungsfreien Laserintensitäten und zog neben Makrophagen, die den Erreger phagozytieren können. Hohe Auflösung, Durchlicht und Fluoreszenz-basierten Filmen etabliert die Fähigkeit zur frühen Ereignisse der Phagozytose in lebenden Zellen zu beobachten. Zur Demonstration der breiten Anwendbarkeit in der Immunologie, wurden primäre T-Zellen auch gefangen und manipuliert werden, um Synapsen mit anti-CD3 beschichteten Mikrokügelchen in vivo bilden und Zeitraffer-Bildgebung der Synapsenbildung wurde ebenfalls erhalten. Durch die Bereitstellung einer Methode, um feine räumliche Steuerung von Live-Erreger in Bezug auf Immunzellen ausüben können zelluläre Interaktionen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit minimaler Störung von Zellen aufgenommen werden und können leistungsfähige Einblick in frühen Reaktionen der angeborenen und erworbenen Immunität zu erhalten.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Eine Methode ist beschrieben, einzeln auswählen, bearbeiten und Bild zu leben Erreger mit einer optischen Falle gekoppelt an eine sich drehende Scheibe Mikroskop. Die optische Falle bietet räumliche und zeitliche Steuerung von Organismen und legt sie neben Wirtszellen. Fluoreszenzmikroskopie erfasst dynamische interzelluläre Wechselwirkungen mit minimaler Störung der Zellen.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Herstellung optischer Qualität Glasflächen, Makrophagen Fusion zu studieren

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

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Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...