Name: subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Vereniging voor Musculaire Dystrofie, NIH (NS062320).

1. Subcutane toediening van muscarine acetylcholine receptor (mAChR) antagonisten <ol><li> Bereiden onder aseptische omstandigheden de juiste dosis van mAChR antagonist, (cf. tabel) door het oplossen van het geneesmiddel in steriele fysiologische zoutoplossing in 1,5 ml reactie buis. De volgende antagonisten werden gebruikt: atropine, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Teken 50μl van de oplossing in a1cc insulinespuit en gebruik een aparte spuit voor elke muis. Ook voorbereiden spuiten met fys...

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

De methode maakt hier gepresenteerde onderzoek van niet eerder opgenomen rollen van subtype-specifieke mAChR signalering in de stabiliteit en het onderhoud van zoogdieren NMJs. Deze methode zal ook nuttig zijn om de effecten van neurotrofe factoren en farmacologische stoffen te testen. Bijvoorbeeld: ons laboratorium bleek dat ciliaire neurotrofe Factor (CNTF) veroorzaakte ontspruit uit bijna alle LAL zenuwuiteinden in volwassen muizen <a>1</a> . Dit resultaat in contrast met eerdere studies van CNTF behandelde achterste...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> ketamine </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dosis: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazine </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dosis: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% zuiverheid); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Farmaceutische kwaliteit </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dosis: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dosis: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptiden International </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 M - 1M </td></tr><tr><td> 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Visser </td><td> T353-500 </td><td> Maak 10% oplossing eerst door het oplossen van 10g/100mL gedeïoniseerd gedistilleerd water, maak 4% met 1X PBS, de pH instellen op 7,4 </td></tr><tr><td> Natrium pentobarbitol </td><td> Virbac Animal Health </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dosis: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Part # 184 </td><td> Volg de instructies die bij kit, kunnen meerdere grote cultuur schotel te gebruiken (30mm, 60mm, 100mm), afhankelijk van de behoeften </td></tr><tr><td> 0,1 M Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Voeg 0.185g aan 25ml van 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% Bovine serum albumine (2% BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Los 2g BSA in 100 ml 1X PBS </td></tr><tr><td> 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS (Blocking Buffer) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100ml </td><td> Los 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger monoklonalen </td><td> SMI312 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Developmental Studies Hybridoma Bank </td><td> SV2-Supernatant </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-geit anti-muis lgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:200, maar als achtergrond hoog is, probeer dan 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647-geconjugeerd geit anti-konijn </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescerende montage media </td><td> Vector laboratoria </td><td> H-1000 </td><td> Dit is geen hard-set media, moet u het dekglas met heldere nagellak te beveiligen. </td></tr><tr><td> Kleine Spring Schaar </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection pincet </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

Achterste ledematen spieren van knaagdieren, zoals de gastrocnemius en de m. tibialis anterior, worden vaak gebruikt voor in vivo farmacologische studies van de signalen essentieel voor de vorming en instandhouding van zoogdieren NMJs. Echter, drugs penetratie in deze spieren na subcutane of intramusculaire toediening is vaak onvolledig of oneffen en vele NMJs kunnen blijven onaangetast. Hoewel de systemische toediening met apparaten zoals mini-pompen kunnen het verbeteren van de spatiotemporele effecten, kan het invasieve karakter van deze aanpak leiden tot verwarrende ontstekingsreacties en / of directe spierschade. Bovendien is het volledige analyse van de NMJs in een achterste ledematen spier een uitdaging, want het vereist tijdrovende serie snijden en uitgebreide immunokleuring. De muis LAL is een dunne, vlakke plaat van de spieren oppervlakkig gelegen op het dorsale gedeelte van de nek. Het is een fast-twitch spier die functies te bewegen de oorschelp. Het bevat rostrale en caudale delen die afkomstig zijn van de middellijn van de schedel en uit te breiden zijdelings aan de kraakbenige gedeelte van elk oorschelp. De spier wordt geleverd door een tak van de nervus facialis die caudaal projecten dat uit de stylomastoid foramen. Wij en anderen hebben gevonden LAL naar een geschikte preparaat dat voordelen voor het onderzoek van zowel korte als lange termijn in vivo effecten van drugs op NMJs en spieren aanbiedingen zijn. De eerste, de oppervlakkige ligging maakt meerdere lokale toepassingen van drugs onder lichte narcose. Ten tweede, de dunheid (2-3 lagen van spiervezels) staat visualisatie en analyse van bijna alle NMJs binnen de spier. Ten derde, het gemak van ontleden met zijn zenuw intact, samen met het patroon van de innervatie vergunningen aanvullende elektrofysiologische analyse in vitro 9,5. Laatste, en misschien wel het allerbelangrijkste, een klein toegepaste volume (~ 50μl) dekt met gemak de hele spier oppervlak, zorgt voor een uniforme en langdurige blootstelling van al haar NMJs om het geneesmiddel en elimineert de noodzaak voor een systemische benadering 1,8.

Watch this Scientific Journal Video about Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice at JoVE.com

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

We beschrijven de procedures voor de herhaalde toediening van remmers van muscarine-signalering naar de levator Auris longus (LAL) spier van jong volwassen muizen en voor de daaropvolgende immunokleuring van de neuromusculaire verbindingen (NMJs) in wholemounts. De LAL spier heeft unieke voordelen voor het openbaren van<em&gt; In vivo</em&gt; Farmacologische effecten op de NMJs.

Subcutane toediening van muscarine antagonisten en Triple-Immunokleuring van de Levator Auris longus in Muizen

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Beoordeling van Ultrasone Spreken Tijdens Drug Zelf-toediening bij ratten

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Microdialyse van alcohol tijdens de operante ethanol zelftoediening en ethanol bepaling door gaschromatografie

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

Proprioceptie en Tension Receptoren in Crab Ledematen: Student Laboratorium Oefeningen

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Een eenvoudige en goedkope methode voor het bepalen Koude Gevoeligheid en aanpassing in Muizen

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging en Maps Spatiotemporal om gastro-intestinale motiliteit analyseren in Muizen

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Een Protocol voor de administratie van Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Recording Brain Electromagnetic Activity During the Administration of the Gaseous Anesthetic Agents Xenon and Nitrous Oxide in Healthy Volunteers

Opname elektromagnetische hersenactiviteit tijdens de toediening van de gasvormige verdoving agenten Xenon en nitreuze Oxide bij gezonde vrijwilligers

Anesthesia arguably provides one of the only systematic ways to study the neural correlates of global consciousness/unconsciousness. However to date most ...