Name: subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Muscular Dystrophy Association, le NIH (NS062320).

1. Administration sous-cutanée du récepteur de l&#39;acétylcholine muscariniques (mAChR) antagonistes <ol><li> Préparer dans des conditions aseptiques la dose appropriée de l&#39;antagoniste mAChR, (cf. tableau) en dissolvant le médicament dans du sérum physiologique stérile dans le tube de réaction 1.5ml. Les antagonistes suivants ont été utilisés: l&#39;atropine, méthoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Tirage 50 pl de la solution dans la seringue d&#39;insuline et de a1cc utiliser une...

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

La méthode présentée ici permet d&#39;établir le rôle précédemment non reconnu de sous-type de signalisation mAChR dans la stabilité et le maintien de NMJs mammifères. Cette méthode sera également utile pour tester les effets de facteurs neurotrophiques et des agents pharmacologiques. Par exemple, notre laboratoire a révélé que le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), a suscité la germination de presque tous les terminaisons nerveuses LAL chez la souris adulte <a>1</a> . Ce résultat contraste avec les ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> kétamine </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dose: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazine </td><td> Laboratoires Lloyd </td><td> LA33806 </td><td> Dose: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (Pureté&gt; 98%); Dose: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Qualité pharmaceutique </td></tr><tr><td> Méthoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dose: 100 - 400m </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dose: 2,5 mg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1105 </td><td> 250 M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptides international </td><td> PMT-4340-S </td><td> 0,1 - 1M </td></tr><tr><td> Phosphate 1X saline tamponnée, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Fisher </td><td> T353-500 </td><td> Faire solution à 10% d&#39;abord par dissolution 10g/100mL eau désionisée distillée; faire 4% avec du PBS 1X, ajuster le pH à 7,4 </td></tr><tr><td> Sodium pentobarbital </td><td> Santé Animale Virbac </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dose: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Partie # 184 </td><td> Suivez les instructions qui viennent avec un kit, peut utiliser plusieurs boîte de culture de taille (30mm, 60mm, 100mm) en fonction des besoins </td></tr><tr><td> Glycine 0,1 M </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Ajouter 0.185g à 25ml de 2% de BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA 2%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Dissoudre 2g BSA dans 100mL d&#39;PBS 1X </td></tr><tr><td> Triton X100 à 0,2% dans 2% BSA / PBS (tampon de blocage) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100mL </td><td> Dissoudre 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxine </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Monoclonaux Sternberger </td><td> SMI312 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Des études de développement de la Banque d&#39;hybridomes </td><td> SV2-Surnageant </td><td> Utiliser à une concentration de 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:400 </td></tr><tr><td> FITC de chèvre anti-souris IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:200, mais si le fond est élevé, essayez 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647-chèvre anti-lapin conjugué </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Utiliser à une concentration de 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescentes montage de médias </td><td> Laboratoires Vecteur </td><td> H-1000 </td><td> Ce n&#39;est pas un média dur est défini, vous aurez besoin pour assurer la lamelle avec du vernis à ongles transparent. </td></tr><tr><td> Ciseaux petit ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Pinces à dissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

Muscles des membres postérieurs des rongeurs, comme les gastrocnémiens et du jambier antérieur, sont fréquemment utilisés pour les études pharmacologiques in vivo des signaux essentiels pour la formation et la maintenance de NMJs mammifères. Cependant, la pénétration du médicament dans ces muscles sous-cutanée ou intramusculaire est souvent incomplète ou inégale et de nombreuses NMJs peut rester inchangée. Bien que l&#39;administration systémique de dispositifs tels que des mini-pompes peuvent améliorer les effets spatio-temporelle, le caractère invasif de cette approche peut entraîner de confusion réponses inflammatoires et / ou des dommages musculaires directes. Par ailleurs, l&#39;analyse complète de la NMJs dans un muscle du membre postérieur est difficile car elle nécessite beaucoup de temps coupes sériées et immunomarquage vaste. Le labo de la souris est une fine feuille plate de muscle situé superficiellement sur le dos de la nuque. C&#39;est un tic musculaire rapide que les fonctions pour déplacer le pavillon de l&#39;oreille. Il contient des portions rostrales et caudales qui proviennent de la ligne médiane du crâne et s&#39;étendent latéralement à la partie cartilagineuse de chaque penne. Le muscle est innervé par une branche du nerf facial que les projets caudalement à sa sortie du trou stylo-mastoïdien. Nous et d&#39;autres ont trouvé du labo pour être une préparation pratique qui offre des avantages pour l&#39;enquête des deux courts et à long terme les effets in vivo de médicaments sur NMJs et les muscles. Tout d&#39;abord, sa localisation superficielle facilite multiples applications locale de médicaments sous anesthésie légère. Deuxièmement, sa minceur (2-3 couches de fibres musculaires) permet la visualisation et l&#39;analyse de presque tous les NMJs dans le muscle. Troisièmement, la facilité de le disséquer avec ses nerfs intacts avec le modèle de son innervation permet une analyse supplémentaire électrophysiologiques in vitro de 9,5. Enfin, et surtout, un petit volume appliqué (~ 50 pl) couvre facilement la surface du muscle entier, offre une exposition uniforme et prolongée de tous ses NMJs à la drogue et élimine la nécessité d&#39;une approche systémique 1,8.

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Nous décrivons les procédures de l&#39;administration répétée d&#39;inhibiteurs de la signalisation muscariniques à l&#39;longus releveur Auris (LAL) de muscle de souris adultes jeunes et d&#39;immunomarquage ultérieure de ses jonctions neuromusculaires (NMJs) dans des échantillons entiers. Le muscle a des avantages uniques du labo pour révéler<em&gt; In vivo</em&gt; Effets pharmacologiques sur NMJs.

Administration sous-cutanée des antagonistes muscariniques et Triple-Immunocoloration du muscle releveur Longus Auris chez la souris

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